[发明专利]应用聚合酶链反应对小麦真菌病原体的检测

说明书

本发明涉及种特异性引物在聚合酶链反应测定中对于小麦真菌病原体检测的应用。这些引物的应用使真菌病原体特定分离株的检测以及植物种群中疾病发展的监测成为可能。

确实需要发展能在感染过程早期对病原体真菌的特定种进行鉴定的技术。通过病症在作物群丛中变得明显之前鉴定病原体的特定种，农业工作者能估计病原体在作物品种中进一步发展的可能作用，如果作物中病原体已被鉴定，并且如果认为这种应用是必要的，能选择一种合适的杀真菌剂。

本发明涉及植物病原真菌不同致病型的鉴定方法。本发明提供了显示不同真菌致病型间变异性的内部转录间隔区(ITS)DNA序列。这些DNA序列在本发明的方法中是有用的，因为能用它们衍生引物，用于基于聚合酶链反应(PCR)的诊断性试验。在特定真菌致病型提供DNA模板的PCR反应中，这些引物产生独特的片段，从而能用来在病症发作之前鉴定特定致病型在宿主植物材料中的存在或不存在。

在一种优选实施方案中，本发明提供了关于病原体早熟禾镰孢(Fusarium poae)、燕麦镰孢(Fusarium avenaceum)和Microdochiumnivale的ITS1和ITS2 DNA序列。在另一种优选实施方案中，本发明提供了关于镰孢属的种和Microdochium nivale的检测的ITS衍生的诊断性引物。

本发明提供了估计特定作物品种-病原体菌株关系中的潜在损害的可能性，以及审慎地使用可获得的多种杀真菌剂库的可能性。此外，本发明能用来提供关于特定病原体种在扩大的地理区域中发育与扩散的详细信息。本发明提供了一种特别适用于具有长潜伏期的疾病的检测方法。

也提供了在本发明的实行中有用的试剂盒。这些试剂盒在真菌病原体镰孢属的种和Microdochium nivale的鉴定中特别有用。

本发明提供了可用于鉴定植物病原真菌不同致病型的独特的DNA序列。特别地，这些DNA序列能在基于PCR的分析中作为引物用于真菌致病型的鉴定。本发明的DNA序列包括特定真菌病原体核糖体RNA基因区的内部转录间隔区(ITS)序列，以及来源于这些区能鉴定特定病原体的引物。这些来源于一种病原体种或属的不同致病型的ITSDNA序列，随该种或属的不同成员而不同，能用来鉴定特定的成员。

生物医学研究人员应用基于PCR的技术已经有一段时间，并且适度成功地检测了被感染的动物组织中的病原体。然而只是最近，才将该技术用于检测植物病原体。应用对病原体线粒体基因组特异的序列的PCR，检测了感染的小麦中Gaumannomyces graminis的存在(Schlesser等人，1991；应用与环境微生物学(Applied and Environ.Microbiol.)57：553-556)，而随机扩增多态DNA(即RAPD)标记能区别Gremeniella abietina的大量种，其为针叶树scleroderris canker的病因。美国专利号5,585,238(在此完全引入作为参考)描述了来源于壳针孢属(Septoria)、假尾孢属(Pseudocercosporella)和球腔菌属(Mycosphaerella)菌株核糖体RNA基因区ITS序列的引物，及其在利用基于PCR的技术鉴定这些真菌分离株中的应用。此外，WO 95/29260(在此完全引入作为参考)描述了来源于镰孢属(Fusarium)菌株核糖体RNA基因区ITS序列的引物，及其在利用基于PCR的技术鉴定这些真菌分离株中的应用。此外，欧洲专利申请号97810779.5(在此完全引入作为参考)描述了来源于尾孢属(Cercospora)、长蠕孢属(Helminthosporium)、球梗孢属(Kabatiella)和柄锈菌属(Puccinia)菌株核糖体RNA基因区ITS序列的引物，及其在利用基于PCR的技术鉴定这些真菌分离株中的应用。

核糖体基因由于其高拷贝数而适于用作分子探针靶。尽管成熟rRNA序列之间高度保守，但非转录及转录间隔区序列通常不保守，因而适于作为靶序列用于近代进化趋异的检测。真菌rRNA基因以单位组成，其每一个编码18S(小亚单位)、5.8S和28S(大亚单位)的三种成熟亚单位。这些亚单位被大约300bp的两种内部转录间隔区ITS1和ITS2隔开(White等人，1990；于：《PCR方案》；Innes等人编；315-322页)。此外，这些转录单位被非转录间隔序列(NTS)隔开。ITS和NTS序列尤其适用于不同真菌病原体的特定致病型的检测。