[发明专利]脂酰辅酶A∶脂肪醇酰基转移酶

说明书

技术领域

本发明涉及酶，纯化和得到该酶的方法，有关该酶的氨基酸和核酸序列，以及将这种组合物用于基因工程的方法。

引言

背景

通过植物基因工程技术的发展，可以转化和再生多种植物以提供具有新的和所需特性的植物。这种植物基因工程技术的一个有价值的领域是在植物组织中生产有利可图的产物。该应用需要在转化事件中使用多种DNA构建体和核酸序列以产生能生产所需产物的植物。例如，基因序列的适当表达需要植物功能性的启动子，所述表达可在整个植物或选定植物组织中进行。另外，经常使用选择性的标记序列来鉴定转化的植物材料。这种植物启动子和可选择的标记提供了有价值的工具，该工具可用于得到新的植物。

涉及这种基因工程技术的所需目标是能提供具有方便的蜡酯来源的谷类植物。包括药品，化妆品，去污剂，塑料和润滑剂的多种工业应用都需要蜡酯。蜡酯，尤其是长链蜡酯以前得自危险的物种鲸，最近得自沙漠灌木jojoba。这些来源都无法便利地提供蜡酯，因此，为了得到可靠来源的该化合物，需要转化谷类植物，其在培养，收获和产物提取方面易于操作。

然而，为了得到这种转化植物，必需首先得到负责所需蜡酯产物之生物合成的基因。至少两种酶活性的作用会导致蜡酯生产，它们是脂酰还原酶和脂酰：脂肪醇酰基转移酶，或蜡合酶。另外，β-酮脂酰-ACP合酶通过为还原酶和蜡合酶的酶促反应提供很长链的脂酰辅酶A底物也参与蜡的生物合成。初步研究这些酶和深入分析并纯化脂酰还原酶，结果表明这些蛋白质与膜有关，然而，仍未确切表征负责蜡生物合成中脂酰：脂肪醇连接反应的酶。因此，需要进一步研究并最终纯化此酶以得到编码酶活性的基因序列。

因此，需要设计纯化方案，籍此得到蜡合酶蛋白和测定其氨基酸序列和/或得到特异于蜡合酶的抗体。在此方法中，可使用文库筛选，聚合酶链反应(PCR)或免疫学技术来鉴定表达蜡合酶蛋白的克隆。分析以此方法得到的克隆以鉴定对应于蜡合酶活性的核酸序列。然后将蜡合酶核酸序列与脂酰还原酶蛋白联合使用以在宿主细胞中生产蜡酯，所述脂酰还原酶蛋白对转基因宿主细胞而言是天然的或是由重组技术提供的。

相关文献

据报道处于发育中的jojoba胚的无细胞匀浆物具有酰基辅酶A脂肪醇酰基转移酶活性。此活性与通过差速离心形成的漂浮的蜡层有关(Pollard等(1979)文献同上；Wu等(1981)文献同上)。

Wildner和Hallick(The Southwest Consortium Fifth Annual Meeting,1990-4-22至24,Las Cruces,NM.)报道了得自具有脂酰S辅酶A转酰基酶活性之Euglena Gracilis的多酶复合物的溶解。

Pushnik等(The Southwest Consortium Fifth Annual Meeting,1989-2-7,Riverside,Ca)报道了jojoba乙酰辅酶A：醇转酰基酶蛋白的10倍纯化。

Garver等(分析生物化学(1992)207:335-340)报道了测定jojoba酰基辅酶A：醇转酰基酶活性的方法。

WO93/10241涉及植物脂酰辅酶A：脂肪醇O-酰基转移酶。jojoba57KD的蛋白质被鉴定为jojoba脂酰辅酶A：脂肪醇O-酰基转移酶(蜡合酶)。本申请人后来报道了jojoba 57KD的蛋白质是参与很长链的脂肪酸生物合成的β-酮脂酰-辅酶A合酶(Lassner等，植物细胞(1996)8:281-292)。

Shockey等(植物生理学(1995)107:155-160)还报道了被假定为酰基辅酶A：脂肪醇酰基转移酶的57KD jojoba种子多肽的光亲和性标记。

附图简述

图1提供了得自第一种蜡合酶纯化方案的柱组分中蜡合酶活性的分析结果，图1A为Blue A琼脂糖层析的结果，图1B为陶瓷羟基磷灰石层析的结果，图1C为sephracryl S-100大小排阻层析的结果，图1D为羟基磷灰石层析的结果。

图2提供了得自第二种蜡合酶纯化方案的柱组分中蜡合酶活性的分析结果，图2A为Blue A琼脂糖层析的结果，图2B为羟基磷灰石层析的结果，图2C为Superdex 75大小排阻层析的结果。

图3提供了由引物WSPEP14-F1和WSPEP33-R2(图3A)所得PCR产物的核苷酸序列和由5’和3’RACE产物(图3B)推定的jojoba脂酰辅酶A：脂肪醇O-酰基转移酶的完整核苷酸序列。