[发明专利]用于治疗和预防多毒素梭状芽胞杆菌毒素导致的疾病的氨基酸序列

说明书

治疗和预防多毒素梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)毒素引起的疾病的氨基酸序列

本发明的内容是从产生抗体的细胞、特别是产生单克隆抗体的杂交瘤细胞获得可中和多毒素梭状芽胞杆菌产生的内毒素和/或细胞毒素的氨基酸序列(多肽)。此外，对人体化的针对多毒素梭状芽胞杆菌毒素的单克隆抗体以及单克隆抗体的多变区作了描述。最后，本文也讲了获得这些氨基酸序列(多肽)的途径以及单克隆抗体的具体应用。

众所周知，大环内酯抗菌素如克林达霉素(Clindamycin)可引起严重的肠道疾病，表现为腹泻，严重时甚至有致死的假膜性结肠炎(PMC)出现。起先，这些疾病被称为“克林达霉素相关的腹泻”，现今，人们知道几乎所有在临床上采用的抗菌素和细胞抑制剂都可以导致PMC的临床表现。

临床上，严重腹泻是PMC的突出症状，由于体液和电介质的严重损失而导致死亡。随轻重不同，可出现腹部疼痛、血性腹泻、高热和白细胞增多。目前的治疗是停用抗菌素并给予万古霉素以及平衡液体和电解质。

很长时间，人们都没有弄清楚假膜性结肠炎的病因。直到1977年，证实大便中存在有毒性作用，这种毒性作用对CHO-细胞(中国地鼠卵巢肿瘤细胞)有细胞毒作用。进一步的研究证实，假膜性结肠炎的原因是多毒素梭状芽胞杆菌及其毒素。

多毒素梭状芽胞杆菌是专性厌氧、革兰氏染色阳性杆菌。它可形成近末端卵圆芽胞。其生化特点是可酵解单糖如葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰神经氨酸，但不能酵解甘露糖、木糖和阿拉伯糖。由于缺乏神经氨酸酶、β-半乳糖甙酶或涎酸酶，多毒素梭状芽胞杆菌不能将这些单糖从胃肠粘蛋白的侧链上裂解开来。在正常人体中，由于其生化特性，梭状芽胞杆菌在肠道不能构成危害。采用抗菌素或细胞抑制剂时，肠道正常菌丛因多毒素梭状芽胞杆菌而失调，后果就是PMC。

多毒素梭状芽胞杆菌产生两种致病因子：内毒素(A毒素)和细胞毒素(B毒素)。这两种毒素的获得、提纯、特性以及它们在制造单克隆抗体方面的应用，在欧洲专利说明书153 519和209 273、美国专利说明书4 879 218和5 098 826以及国际专利登记WO91/18293中都有详细说明。

显然，抗体在防止多毒素梭状芽胞杆菌感染的后果中起着很重要的作用。在PMC患者身上，可以查到针对A毒素和B毒素抗体。给地鼠抗菌素以后，再将其感染可产生毒素的多毒素梭状芽胞杆菌，可以在它们身上观察到典型的PMC，并且地鼠因此而死亡。如果事先用毒素对地鼠进行免疫，则它们不会患病。而毒素可以用抗体进行中和，这些抗体针对C-末端重复配体片段、中央移位片段或针对N-末端催化片段而发挥效用(片段结构请参见文献〔1〕)。第一种情况防止了毒素和细胞受体的结合，后种遏制了毒素介导的糖酵解反应，而针对中央移位片段的抗体阻止毒素向细胞内侵入。

这样，中和A毒素和/或B毒素的抗体提供了一个治疗和/或预防多毒素梭状杆菌引起的疾病的可能性，其作用方式不是灭菌，而是遏制毒素的作用。相应疾病的治疗和预防是对因的。

以A毒素为例，DSM ACC 2322细胞系可产生TTC8抗体，此抗体不仅和A毒素结合，而且也可中和其生物作用。TTC8抗体和A毒素结合的位置已经确定是在重复配体片段内。抗体和毒素的结合防止了后者和细胞受体的结合。单克隆抗体TTC8的结合位置是在A毒素的2480-2539氨基酸之间，其抗原序列(很可能)是TINGKYYF。美国US4879218号专利说明中的单克隆抗体PCG-4是和A毒素的2098-2141氨基酸之间的蛋白片段结合。

DSM ACC 2321细胞系产生的单克隆抗体2CV同样是和B毒素的配体片段向结合。位置是在B毒素的2233-2366氨基酸之间的蛋白片段。单克隆抗体PCG-4和单克隆抗体TCC8都是小鼠抗体，它们虽不适于人体治疗，但很适合作为诊断的辅助工具。

下面是我们实验室生产的单克隆抗体及其特性：

针对目标            毒素^a)            毒素^b)

催化片段^b)         1212               2612，2688，3110，

                                       1502，1115

移位片段^b)         2825，2836，5288   2703，2740，