[发明专利]造血祖细胞长时培养的方法和设备

说明书

本发明的领域

本发明概括地是涉及造血细胞，更具体地是涉及体外造血细胞长时培养的方法和设备，以及将外源基因材料引入造血源细胞中的方法。本发明的背景

循环血细胞，如红血球，白血球，血小板，淋巴细胞，是可识别前体是终末分化产物。在胚胎生命中，造血细胞出现在整个网状内皮系统中。在正常成人中，可识别前体的终末分化仅出现在骨骼中轴骨髓腔中，延伸到最接近的股骨和肱骨中。而这些前体细胞是从称作祖细胞的不成熟细胞起源的，通过它们在半-固态介质中，如甲基纤维素，培养1-3周发育成成熟血细胞邻近集落测定。

有关造血祖细胞的分离和提纯已有报道(参阅美国专利第5,061,620号)，但这种方法还不允许这种细胞的长时培养并保持它们的生存能力和多能性。

对鼠科动物骨髓中鼠科造血系统的研究已对鼠科系统有了详细的了解。此外，将逆转录基因转移到培养的鼠骨髓细胞中已成为可能。虽然转移逆转录基因到培养的鼠骨髓细胞中已成为可能，但基因转移到人类骨髓细胞中的效率一直令人失望，这反映出了人类长时骨髓培养一直受到骨髓细胞寿命，及更重要的保持造血祖细胞长时存活和多能性能力的事实限制。

最初发现人类骨髓培养物具有有限的造血潜能，产生减少量的造血祖细胞和成熟血细胞，细胞产出停止六到八周。对原始系统随后的修正只产生了很小的改进。这很大程度是由于造血祖细胞对环境影响及在体内发现的重要生长因子(造血细胞生长因子和细胞因子)的依赖。除了这些因素，细胞表面分子和胞外基质的相互作用对于造血祖细胞的存活和扩增是很重要的。以前提高造血祖细胞体外扩增和分化的尝试，是检测各种底物中细胞因子的效用，包括预种的基质和纤维结合蛋白。在培养环境中加入外源生长因子，特别是IL-3(白介素-3)和GM-CSG(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)，可能会导致特异种类细胞的选择性扩增。这些发现显示，在造血祖细胞培养物中加入外源生长因子，致使原造血祖细胞的分化，从而耗尽了不成熟造血祖细胞量，会不利地影响原造血祖细胞的多能性。

其他方法是使用照射过的骨髓基质来种造血祖细胞，已显示出在长时培养原始细胞(LTCICs)中保持了这些细胞，并通过逆转录病毒载体增加造血祖细胞和LTCICs的转导。然而，这样产生了非自身骨髓移植免疫反应和感染的风险问题。纤维结合蛋白，一种细胞基质组分，在加强逆转录病毒转导时，减小了感染和免疫调节反应风险。然而，仅使用纤维结合蛋白对保持体外原造血祖细胞是不够的。

骨髓的三维微环境在保持造血干细胞生存能力和多能性方面起作用的假说，导致对模拟这种拓扑结构的研究。三维聚合物设备(如尼龙网)已显示出支持造血祖细胞的存活，扩增和多种类分化，但需要存在生长因子。这些因子可以外源加入，或通过与祖细胞共同培养的分泌基质细胞提供，或可通过加入基质细胞调节培养基。

骨髓移植的造血祖细胞扩增是人类长时骨髓培养物潜在的应用。人类自身和同种异体骨髓移植是目前用作治疗如白血病，淋巴瘤和其他危害生命疾病的方法。然而，对于这些方法，必须移出大量供体骨髓以保证有充足细胞输注。

提供造血祖细胞扩增的方法降低了对大量捐献骨髓的需要，使获取少量的捐献骨髓，然后在输注到受体之前体外扩增祖细胞的量成为可能。同样，已了解到少量的造血祖细胞在血流中循环。如果这些细胞可以选取并扩增，那么就有可能从外周血液中来获取移植所需量的造血祖细胞而减小对骨髓捐献的需要。

造血祖细胞扩增作为化疗的辅助治疗也是很有用的，并且是人类长时骨髓培养物另一种应用。多数化疗试剂通过杀死所有细胞完成细胞分裂起作用。骨髓是身体内最丰富的组织，因此，常常是化疗药物最开始损害的器官。结果是在化疗期间血细胞的产生迅速被破坏，在患者重新进行化疗治疗之前必须中止化疗以使造血系统补充血细胞供给。

提供造血祖细胞扩增成功的方法会大大促进产生大量进一步分化的特异种类前体细胞，从而提供大量分化的造血细胞，其具有很多用途，包括输血。

基因治疗在医学中是成长很快的领域，具有巨大的临床潜能。一般，基因治疗被定义为为了修正先天的基因错误，将外源基因引入到患者的细胞中。对基因治疗的研究在体外几种类型的细胞中和对动物的研究中已经进行了多年，最近一些临床试验已经开始。