[发明专利]蛋白质－胶体金属－氨基葡聚糖包覆的粒子及其制备方法和用途

说明书

本发明一般涉及新颖的流式血细胞计数和细胞分离及试剂，更具体地说，本发明涉及新颖的由结合有蛋白质的胶体金属和氨基葡聚糖包覆底物而形成的粒子以及这种粒子的制备方法和用途。

流式血细胞计数技术为研究者提供了细胞的物理参数数据，该技术用于分离不同种类的细胞，例如将白细胞分成三个主要的组类，即淋巴细胞、单核细胞和巨核细胞。业已描述了其他技术用于鉴定其他白细胞种群，例如T-细胞、B-细胞、胞毒细胞和阻抑细胞、中性粒细胞、嗜酸性细胞和嗜碱性细胞。例如参见“流式血细胞计数和分类”，第371页，由Melded，Mullaney和Mendelsohn编辑(1979年)，JohnWiley&Sons，N.Y.，N.Y.；美国专利5,125,737；美国专利5,492,833；美国专利5,223,398；美国专利5,231,005。

现有技术的亚类计数方法是利用涂覆有抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒靶向全血中特定的白细胞亚群，其结果是使靶细胞的体积、直流或低频电流(DC)或高频(RF)电导以及光散射方面发生变化(位移)。例如参见1992年6月11日公开的PCT申请WO92/09682；J.C.Hudson等人的“血细胞计数”，22：150(1995年)；美国专利5,639,620以及1995年9月14日公开的国际专利申请WO95/24631。事实上，可利用市售的血液学仪器，例如配备有VCS技术的COULTER^STKS^TM仪器检测到后三种变化。这些仪器能计算白细胞总数中位移细胞数所占的百分比。

以上由颗粒引发位移的所有方法都用到一种结合有抗体的聚苯乙烯颗粒，以便一次只对淋巴细胞亚群计数。使用无机材料颗粒产生位移的方法直到最近才有记载。例如参见美国专利5,466,609；国际专利申请WO9524631；美国专利5,552,086。特别是金/银胶体包覆的聚苯乙烯-氨基葡聚糖颗粒及其制备方法和特征已有记载。例如参见美国专利5,248,772和美国专利5,552,086。

目前对淋巴细胞进行分类的方法包括使用荧光标记物和测定前光散射、侧光散射和荧光强度或者利用颗粒上的抗体并测定中心角度的光散射、DC和RF。因此，利用颗粒上的抗体在任一次分析淋巴细胞的一个亚群时，只涉及到一种类型的涂覆有抗体的颗粒。还可参见P.K.Horan和L.L.Wheeless，Jr.，“科学”198：149-157(1997)；以及1980年2月13日公开的英国专利1561042。另一方面，常规使用的具有荧光标记物的流式血细胞计数同时使用了多种荧光标记的抗体(2-6)，来分析白细胞的不同亚群。

目前，还没有一种方法能用颗粒上抗体来分析血液样品，从而可同时对淋巴细胞的多种亚群进行计数。因此，本领域需要有能够更有效地分析血液或其他多细胞流体物质的组合物和方法。

本发明一方面提供了一种稳定的胶体粒子，该粒子包括：

(a)一个具有能够与胺反应的官能团的胶体大小的核底物；

(b)所述底物的外表面上有一层氨基葡聚糖涂层；

(c)一层覆盖所述氨基葡聚糖涂层的胶体大小的金属固体，所述金属固体中的金属是由那些能够被上述核底物的氨基葡聚糖涂层从离子态还原成金属态的金属中选择的；

(d)一种附着到所述金属固体上的键合剂，所述键合剂具有游离的氨基；以及

(e)一种通过与所述游离氨基共价键合而附着到所述键合剂上的蛋白质。

另一方面，本发明提供了用于制备上述粒子的方法，包括利用氨基三硫醇键合剂将蛋白质结合到包覆粒子上的方法。

再一方面，本发明提供了利用上述粒子在一种生物溶液或悬浮液中，如全血中，同时定量测定两种或多种白细胞亚群的方法。

以下通过参考附图和优选实施例详细描述本发明，进一步阐述本发明的其他方面和优点。

图1是醛/硫酸酯聚苯乙烯胶乳颗粒(PS)悬浮液的电泳淌度-pH值曲线图，其中PS未包覆或已包覆有氨基葡聚糖(Amde×)、金胶体、氨基三硫醇键合剂以及抗-CD4(T4)抗体或抗-CD8(T8)抗体。

图2是醛/硫酸酯PS悬浮液的电泳淌度-pH值曲线图，其中PS未包覆或已包覆有1，3-二氨基丙烷(DAP)、4-〔N-马来酰亚胺甲基〕环己烷-1-羧酸硫代琥珀酰亚胺酯(硫代-SMCC)以及T4或T8抗体，所有试剂都只用1×磷酸缓冲盐(PBS)冲洗。