[发明专利]寡核苷酸的溶液相合成

说明书

本发明提供基于H-膦酸酯偶联和现场硫转移、于低温下进行的在溶液中合成寡核苷酸和硫代磷酸寡核苷酸的方法。本发明还提供分步合成寡核苷酸和硫代磷酸寡核苷酸的方法(其中一次加入一个核苷残基)和区段合成(block synthesis)寡核苷酸和硫代磷酸寡核苷酸的方法(其中一次加入两个或两个以上的核苷酸残基)。

在过去的约15年中，在开发合成寡脱氧核糖核苷酸(DNA序列)和寡核糖核苷酸(RNA序列)及其类似物方面已经取得了许多进展‘Methods in Molecular Biology，第20卷，Protocol for Oligonucleotidesand Analogs’，Agrawal，S.编辑，Humana Press，Totowa，1993。其中许多工作在微摩尔或甚至更小的规模下进行，已经证明涉及单体亚磷酰胺结构单元的自动固相合成(Beaucage，S.L.；Caruthers，M.H.TetrahedronLett.，1981，22，1859-1862)是最便利的方法。事实上，现在可以用市售的合成仪常规制备高分子量DNA序列和相对高分子量的RNA序列。这些合成的寡核苷酸已经满足了生物学或生物技术方面的许多决定性的需要。

根据Zamecnik和Stephenson的开创性发现，合成寡核苷酸可以选择性地抑制劳斯肉瘤病毒中的基因表达(Zamecnik，P.；Stephenson，M.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1978，75，280-284)，合成寡核苷酸或其类似物完全有可能于化疗中获得应用的想法在高校实验室和工业实验室中都已经引起了广泛注意。例如，在Gura，T.Science，1995，270，575-577的报道中已经强调了寡核苷酸及其硫代磷酸类似物在化疗方面的可能用途。所谓的反义和抗原的化疗方法(Oligonucleotides，AntisenseInhibitors of Gene Expression，Cohen，J.S.编辑，Macmillan，Basingstoke1989 Moser，H.E.；Dervan，P.B.Science 1987，238，645-649)已经深深地影响了对合成寡核苷酸的需求。对于分子生物学目的一般毫克量已经足够，而对于临床试验而言，需要量超过100克以上。作为潜在反义药物的几种寡核苷酸类似物现在正在后期的临床试验(advancedclinical trials)中。如果(在非常近的将来看来是可能的)比方说这些序列之一被准许用于治疗AIDS或一种形式的癌，则会需要公斤或更优选数公斤量的一种或多种特定序列。

在过去数年中，在扩大比例的寡核苷酸合成方面进行了大量的工作。实际上，所有这项工作均涉及建立越来越大的合成仪和在固相支持体上的相同的亚磷酰胺化学。在于溶液中合成寡核苷酸的磷酸三酯途径的方法学方面，本申请人不知道有任何最新的改进，于溶液中合成寡核苷酸使得它比固相合成更适于大规模和甚至中等规模的合成工作。

固相合成优于溶液合成的主要优点是：(i)快得多，(ii)偶联得率一般更高，(iii)易于自动化，和(iv)在序列方面完全灵活。因此，如果比方说组合目的需要相对少量的种类繁多的寡核苷酸序列，则固相合成特别有用。然而，如果已经鉴定出特定的中等大小的序列，并作为药物被批准，则需要公斤量，速度和灵活性变得相对不重要，而在溶液中合成可能是非常有利的。溶液合成也具有优于固相合成的优点，在于区段偶联(即一次加入两个或两个以上的核苷酸残基)更可行，规模扩大至任何水平都不大可能出现问题。增大反应容器的大小比制造越来越大的自动合成仪容易得多，并且肯定更便宜。

过去，在溶液中的寡核苷酸合成主要通过在20世纪70年代开发的常规的磷酸三酯途径进行(Reese，C.B.，Tetrahedron 1978，34，3143-3179；Kaplan，B.E.；Itakura，K.‘Synthesis and Applications of DNA andRNA’，Narang，S.A.编辑，Academic Press，Orlando，1987，第9-45页)。该方法也可以用于固相合成，但使用亚磷酰胺单体时偶联反应略快，且偶联得率略高。这就是自动固相合成主要基于使用亚磷酰胺结构单元的原因；它也许也是需要相对大量合成寡核苷酸的工作者决定试图扩大基于亚磷酰胺的固相合成规模的原因。