[发明专利]革兰氏阳性微生物甲酸途径

说明书

本发明的领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及芽孢杆菌属(Bacillus)中参与甲酸运输和利用的分子的鉴定。本发明还提供用于增加芽孢杆菌属(Bacillus)生产多肽的产量的方法。

序言

革兰氏阳性微生物，例如芽孢杆菌属已被应用于大规模工业发酵，部分原因是其能将发酵产物分泌至培养基中。分泌的蛋白质穿过细胞膜和细胞壁导出，随后释放到胞外培养基中。因为导出的蛋白质通常保持其天然构象，所以在革兰氏阳性微生物中生产感兴趣的蛋白质是有利的。

Suppmann等(1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)，vol．11(5)，965-982页)描述了革兰氏阴性微生物大肠杆菌(E．coli)中的一种推断的甲酸转运蛋白。Nagy等(1995，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)，vol：177，1292页)描述了大肠杆菌中的甲酰四氢叶酸水解酶。Mazel等(1997，分子生物学杂志(J．Mol．Biol．)266：939-949)描述了真细菌系统中的多肽去甲酰酶功能。然而，关于大规模发酵法生产异源蛋白质所使用的革兰氏阳性微生物中甲酸的摄取和利用，人们知之甚少。

芽孢杆菌属中可能与甲酸利用相关的基因产物已经得到鉴定。deSiazieu(1997，微生物学(Microbiology)143：979-989)揭示了产生辅酶四氢叶酸(THF)的操纵子。枯草芽孢杆菌(B．subtilis)中已显示存在10-甲酰四氢叶酸合成酶(连接酶)活性和5，10-亚甲四氢叶酸脱氢酶(Whitehead等，1988，细菌学(Bacteriology)170：995-997)。而且，Saxild等(1994，Mol．Gen．Genet．242：415-420)已鉴定了嘌呤生物合成中催化单碳转移反应的5-磷酸核糖-1-甘氨酰胺(GAR)转甲酰酶(transforylase)。该酶是purT位点的产物，发现其依赖于生长培养基或无细胞提取物体外实验中添加的甲酸盐。

在本领域中，仍需要优化革兰氏阳性表达系统以便增加这些系统的产物产量。

本发明概要

在本发明之前，对革兰氏阳性微生物中甲酸的运输、利用或循环知之甚少。当在摇瓶中研究不同添加物对革兰氏阳性微生物芽孢杆菌属生长的影响时，观察到向培养基中添加甲酸钠时生长增加。还观察到在革兰氏阳性微生物发酵过程中没有外源甲酸盐时，产生内源甲酸。

因此本发明部分地基于内源或外源甲酸钠存在时观察到的革兰氏阳性微生物生长的改变。本发明还基于本文提出的证据，即甲酸是通过一种共运输的机制运送至芽孢杆菌属的。因此，本发明提供了改变革兰氏阳性微生物生长的方法，其包括更改革兰氏阳性微生物中甲酸的运输。

本发明还部分基于枯草芽孢杆菌基因组核酸序列编码的四个芽孢杆菌属蛋白的鉴定和特性分析，这些蛋白看来与甲酸的运输、利用和循环相关：甲酸运输相关蛋白1(FTAP1)和甲酸运输相关蛋白2(FTAP2)，其分别与大肠杆菌蛋白FocA(一种甲酸通道蛋白)大约35％和30％相同；枯草芽孢杆菌PurU，其与大肠杆菌PurU(在四氢叶酸和甲酰四氢叶酸循环中涉及的N10-甲酰四氢叶酸水解酶)在氨基酸水平上大约48％相同；甲酰甲硫氨酸去甲酰酶(FMD)，其与另一种甲酰甲硫氨酸去甲酰酶(YkrB)大约40％相似。

本发明还基于如下数据，即在有外源甲酸存在时，摇瓶培养的中断了FTAP1编码基因的芽孢杆菌属细胞显示其生长增加比外源甲酸存在时正常观察到的生长增加降低大约50％。在有外源甲酸存在时，摇瓶培养的中断了FTAP2编码基因的芽孢杆菌属细胞生长得更慢，而且培养物的密度随着时间下降。因此，看来在芽孢杆菌属中FTAP1和FTAP2与甲酸运输和利用相关。

因此，调整甲酸运输、利用和循环所涉及分子(例如，FTAP1、FTAP2、PurU和FMD单独、彼此联合或和其它相关分子联合)的表达，提供了一种调节革兰氏阳性微生物的甲酸产生水平的方法。人们可能期望增加这些分子的表达、降低这些分子的表达或调节这些分子的表达，即提供一种根据革兰氏阳性微生物类型和希望的培养条件在细胞生长的一定时期表达这些分子的方法。