[发明专利]共冷冻干燥法制备肽/脂类络合物

说明书

1．发明领域

本发明涉及用肽和一种或多种脂类，通过共冷冻干燥法制备肽／脂类微囊和络合物，优选使用能采取两性α-螺旋构型的肽。可以将能溶解肽和脂类二者的同一溶液或两种分别的溶液冷冻真空干燥。本方法用于制备稳定的肽／脂类微囊和络合物，包括大量的和适合于用药剂量的较小剂量单位的微囊、球状和圆盘状络合物，但不局限于此。

2．背景技术

脂质体是由至少一层脂类双分子膜包含一个含水核组成的微囊。通常，磷脂含有脂类双分子层，但双分子层可以含有其它脂类。脂质体中的水溶液称为吸收体积。

脂质体已发展为传递药物、化妆品、用于其它方面的生物活性化合物的微囊。脂类双分子层将药物、化妆品、生物活性化合物等包成囊，在脂质体的吸收体积中，脂类双分子层与细胞表面膜接触时，药物从脂质体核排放。脂质体通过脂类交换、融合、细胞吞噬或吸收将内容物释放到细胞内。见Ostro等，1989，美国医院药学杂志46：1576的记载。另一方面，可以将药物、化妆品、生物活性化合物等结合或镶入微囊的脂类双分子膜中。

除微囊外，已经用含脂类的颗粒状络合物输送物质。如，许多研究人员已发现它可以用于制备与高密度脂蛋白(HDL)颗粒有相似体积和密度的重构的脂蛋白类颗粒或络合物。这些重构络合物通常含有纯化的脱辅基蛋白(通常是脱辅基蛋白A-1)和磷脂如卵磷脂。有时，也包括未酯化的胆固醇。制备这些颗粒最常用的方法是(1)通过水浴声处理或探针声处理进行组分的超声处理，(2)蛋白质组分与预先形成的脂类颗粒之间自发地相互作用，(3)由洗涤剂介导的重构，然后通过透析除去洗涤剂。Jonas，1986，酶学方法，128：553-582；Lins等，1993，生物化学和生物物理学学报，1151：137-142；Brouillette＆Anantharamaiah，1995生物化学和生物物理学学报，1256：103-129；Jonas，1992，脱辅基蛋白的结构与功能，第8章：217-250。也通过用两性螺旋型肽取代脱辅基蛋白组分形成相似的络合物。不足的是，各种方法对于在合理的成本-效能基础上形成大量的纯络合物均存在较大的问题。并且，这些出版物未公开两性α-螺旋构型的肽／或肽的类似物和脂类共冷冻干燥的方法。

制备脂类微囊和络合物的一些技术是已知的。已经用各种方案制备微囊，或脂质体，从而形成不同类型的微囊。各种类型的脂质体包括：多层微囊、小单层微囊，和大单层微囊。

用水溶液进行磷脂(或其它脂类)的水合也能产生脂类分散相和自发形成多层微囊(“MLVs”)。一种MLV是有多层脂类双分子层包围中央含水核的脂质体。这些类型的脂质体比小单层微囊(SUVs)大，其直径为350-400nm。在一个圆底烧瓶内将脂类溶解在氯仿中，并蒸发除去氯仿直至脂类在烧瓶壁上形成一薄层，从而制备MLVs。加入水溶液，使脂类层再水合。旋转烧瓶形成微囊。Deamer等，1983，脂质体(Ostro，Ed．)，Marcel Dekker，Inc．纽约(引用Bangham等，1965，分子生物学杂志13：238)。Johnson等随后报道此方法也能产生单层微囊，见Johnson等，1971，生物化学和生物物理学学报233：820。

小单层微囊(SUV)是一种单一脂类双分子层包合一个含水核的脂质体。根据制备SUVs的不同方法，其直径的范围为25-110nm。最早的SUVs的制备方法是：在充氮气条件下向氯仿中的磷脂干燥制备物加水相使脂类浓度在毫克分子范围，在45℃对溶液进行超声处理使其澄明。Deamer等，1983，脂质体(Ostro，Ed．)，Marcel Dekker，Inc．纽约。用此种方式制备SUVs，产生直径在25-50nm的脂质体。

另一种制备SUVs的方法是将一种乙醇／脂类溶液快速注入一种将被包合的水溶液中。Deamer等，1983，脂质体(Ostro，Ed．)，MarcelDekker，Inc．纽约(引用Batzri等，1973，生物化学和生物物理学学报298：1015)。用此种方式制备的SUVs直径为25-50nm。

也可以使多层微囊重复通过一压力为20，000psi．的弗氏压碎器4次制备SUVs。制得的SUVs的直径为30-50nm。Deamer等，1983，脂质体(Ostro，Ed．)，Marcel Dekker，Inc．纽约(引用Barenholz等，1979，欧洲生化学会联合会通讯99：210)。