[发明专利]信号序列捕获方法

说明书

                       技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种检测和分离编码具有分泌能力的肽的DNA的方法。

                        背景技术

至今，已将编码激素或生长因子的基因分离并用于生产许多商业上作为药的重组蛋白。它们中大多数为分泌蛋白。因此，在开发新药中分离编码新型分泌蛋白的基因是一极其重要的步骤。因此，已开发出分离编码分泌蛋白的基因的方法。例如，Honjo等人开发了一种方法(未经实质审查公开的日本专利申请JP-平6-315380)，该方法利用分泌蛋白具有允许胞内表达蛋白转位到细胞表面的信号序列的特征。在该方法中，人体IL-2受体，一种分泌蛋白的α链的信号序列用相应于来自靶细胞或组织的mRNA的5′-末端序列的短cDNA片段替换以构建文库，然后将它导入细胞中。在克隆中，IL-2受体在带有信号序列的克隆的细胞表面上表达，但是不含信号序列的那些克隆却不能。因此，该信号序列的存在可以通过抗-IL-2受体抗体检测。

Genetics Institute，Inc.，(Cambridge，MA)开发了一种利用酵母代谢酶的更复杂的系统(US5536637)。转化酶，一种酵母代谢酶，是一种在培养基中将蔗糖裂解成葡萄糖和果糖以传递能量的分泌酶。不分泌该酶的突变型菌株在没有葡萄糖但含蔗糖作为唯一碳源的培养基中不能生长。在利用该现象的方法中，将转化酶基因与cDNA连接以构建文库，然后将其导入缺乏转化酶基因的突变型酵母菌株中。将含该信号肽的克隆通过选择能在仅含蔗糖作为碳源的培养基中生长的克隆进行分离。

然而，Honjo等人的方法的缺陷在于，由于使用抗体，因此在选择阳性克隆中需要繁复的步骤。而且，检测灵敏度非常低。Genetics Institute，Inc.的方法的问题还在于，不能将酵母中分泌效率差的克隆分离出来。此外，由于当报道基因与大的蛋白融合时抗原性或酶活性可能丧失，因此这些方法仅能检测短DNA。而且，这些方法不能检测N-末端在细胞内而C-末端在细胞外的Ⅱ型膜蛋白。

                   本发明的公开内容

本发明提供了一种检查所试验的cDNA是否编码具有分泌能力的肽的方法。本发明还提供了一种分离编码具有分泌活性的肽的cDNA的方法，它能够使用编码长肽编码区的cDNA。

如细胞因子受体的蛋白质转位到细胞表面，在结合其配体时，其二聚化并诱导细胞增殖。已知蛋白质转位到细胞表面的能力(分泌能力)依赖于信号序列的存在。本发明人认为，通过从蛋白质中去掉信号序列(或具有附加的胞外区)并用含所需肽的融合蛋白替换它，在细胞中表达融合蛋白，并检测细胞的增殖能力，可以检测所需肽是否具有分泌活性。如果肽具有分泌能力，融合蛋白则转位到细胞表面、二聚化、并诱导细胞增殖。与此相反，如果肽不含分泌活性，融合蛋白则不能转位到细胞表面和诱导细胞增殖。因此，可以通过仅检测细胞增殖作为指标来检测所融合的肽的分泌能力。而且，本发明人认为，可以通过选择增殖的细胞对具有分泌能力的肽进行阳性筛选。因此，本发明人使用mpl(血小板生成素受体)作为通过转位到细胞表面并二聚化以触发细胞增殖的蛋白质，并开发出一种检测和分离具有分泌能力的肽的方法。

特别地，我们通过从mpl的组成活性形式去掉分泌信号和大部分胞外域制备了编码人体mpl但没有分泌能力的DNA，这是本发明人发现的(在没有配体的情况下通过转导信号来改变mpl以给IL-3依赖型细胞系提供自主增殖能力；Blood 88：1399-1406(1996))。然后将该DNA与待检测的cDNA、编码已知分泌蛋白的DNA、或编码分泌信号区被除去的分泌肽的DNA连接。所得嵌合基因在细胞中被表达，并检测细胞的增殖能力。结果显示，编码用作测试cDNA的已知分泌蛋白的DNA诱导细胞增殖，然而对编码分泌信号区被移去的分泌蛋白的DNA来说没有检测到细胞增殖。以这种方式，本发明人发现：可以使用如此开发的系统使用细胞增殖作为指标容易地检测并分离编码具有分泌活性并含长肽编码区的肽的DNA。事实上，他们进行了筛选并成功地检测和分离了编码包括Ⅰ型膜蛋白和Ⅱ型膜蛋白的分泌蛋白的DNA。

因此，本发明涉及：

(1)一种肽，其能够在细胞表面通过二聚化诱导细胞增殖并且缺乏分泌能力；

(2)(1)中所述的肽，其中该肽得自细胞因子受体；

(3)(1)中所述的肽，其中该肽得自mpl；

(4)(2)或(3)中所述的肽，其中该肽为配体非依赖型；

(5)(1)中所述的肽，其中该肽包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列；