[发明专利]杆状病毒载体表达系统中蛋白质的表达

说明书

本发明涉及在杆状病毒载体表达系统中增强蛋白质或多肽表达的方法。当重组DNA技术发展起来后，人们期望利用遗传修饰的细菌大规模地生产蛋白质。但是，大多数具有商业价值的蛋白质在它们变成生物活性蛋白质之前需要进行翻译后的修饰。所以，现在更经常用于生产重组蛋白质的是动物细胞。

在动物细胞中，昆虫细胞在重组蛋白质的生产中变得越发重要。现在已经开发了利用昆虫细胞的一个便利和多用途的杆状病毒载体系统。但是，昆虫细胞的生理学资料相当少，通常接受的是杆状病毒重组技术生产的疫苗。一个例子是将I型人免疫缺陷病毒的杆状病毒表达的gp160包膜蛋白作为临床实验中可能的AIDS疫苗。

直到现在，昆虫细胞中大规模生产杆状病毒表达的蛋白质还局限于最多达约10升的生物反应器。为了扩大规模，悬浮培养的可能性最大。在大规模的生产中(参见，Tramper等人，生物技术最新进展，1992，263-284；Power和Nielson，细胞技术20：209-219，1996)，特别应该关注影响细胞生长和病毒生产的因素。这些因素的变化大大地影响了重组蛋白质生产的最后水平。

杆状病毒的特征是通常包含在包含体(也称为多角体)的杆状病毒颗粒。杆状病毒科可以分成两个亚科：真杆状病毒，有两个包含体病毒属：核多角体病毒(NPV)和颗粒体症病毒(GV)，和包括非包含体病毒的亚科裸杆状病毒。人们已经更详细地研究了苜蓿银纹夜蛾(Ac)NPV的细胞和分子生物学。

许多蛋白质已经在编码该蛋白质的重组杆状病毒感染的昆虫细胞中表达。编码意味着将编码异源蛋白质的核酸序列提供给病毒，经常还将调节核酸序列如启动子提供给这种病毒。更常见的是，多角体启动子用于表达外源基因，但p10启动子同样适用，也可使用。

可被重组杆状病毒感染的细胞系有几个。SF-21细胞系是起源于秋粘虫(草地夜蛾)的卵巢组织的。得自美国典型培养物保藏中心(CRL1711)的克隆分离物SF-9或多或少是体外生产重组病毒的标准细胞系，并且据说在生产重组病毒中是优秀的。其它细胞系如从粉纹夜蛾获得的Hi-Five细胞系和Tn-368和Tn-368A细胞系。最广泛利用的昆虫细胞生长培养基包括TNM-FH，BML-TC/10和IPL-41。这些培养基通常或多或少补充了确定的一些成分，如哺乳动物血清，特别是胎牛血清。血清替代品也用于昆虫细胞培养，无血清培养基如Ex-Cell400^TM和Sf900是可以买到的。

通常昆虫细胞在固体支持物上以及悬浮液中生长，但是，据报道，当生长在固体支持物上时病毒的产量较高。当在指数生长期感染细胞时，感染是最有效的，但在细胞周期的不同时期感染的细胞之间，每个细胞产生的多角体和病毒的量没有明显的差异。细胞密度对病毒生产具有很大的影响。昆虫细胞表现出接触抑制的形式，在更高的细胞密度时病毒生产减弱。

每个细胞的感染病毒数，即最初的感染复数(m.o.i.)通常在感染结束时影响感染细胞部分和每个细胞的多角体的数目。通常认为病毒生产的最佳感染复数在20-30左右。在表达β-半乳糖苷酶的重组杆状病毒的研究中(Licari和Bailey，生物技术和生物工程，37:238-246，1991)，Sf-9细胞的感染复数是0-100之间。β-半乳糖苷酶产量增加，并且细胞密度随着感染复数增加而下降。通常认为感染复数的增加或下降只对每个感染细胞的重组蛋白质的最大可得产量有有限影响。但是，选择低的感染复数能减少感染所需要的病毒原液和使杆状病毒的干扰缺损颗粒的产生的危险最小。如果以高感染复数(＞5)感染昆虫细胞的批量培养物，接着发生的感染过程将基本同步，即，所有细胞将同时经过感染循环。当批量培养物中细胞的感染复数是1-5，培养物不再同步。培养物最初将包括非感染细胞和各个感染循环的不同点的细胞，直到所有细胞感染，并且需要的蛋白质的生产结束。通常在这样的培养物中，生产水平更低。培养物行为是不同生产时期的各个细胞的行为的组合，解释了亚最佳生产水平。在连续培养中，连续地加入非感染细胞，培养物将明显地非同步感染。