[发明专利]通过裂解脱碱基位点的核酸产生可延伸的上游DNA片断而鉴定核酸分子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及鉴定核酸分子的方法，所述方法包括裂解脱碱基位点的核酸从而产生可延伸的上游DNA片断。

背景技术

鉴于与下述有关的原因，鉴定靶核酸显得尤为重要：即证实样品中是否存在基因，证实部分或全部核酸序列的存在和筛选DNA中导致遗传病的已知或未知致病突变和天然变异的存在。尽管有很多已知的方法可以用于鉴定核酸和检测未知的序列变化，但所产生的越来越多的新的遗传信息使开发新的，较好和较快的鉴定核酸的方法变得至关重要。

WO 97／03210公开了使用识别经修饰碱基的DNA-糖基化酶直接检测靶核酸样品中已知和未知突变的方法。该方法一般包括联合使用正常的DNA前体核苷酸和一个或多个经修饰的前体核苷酸扩增靶核酸样品，其中经修饰的前体核苷酸替代了一个正常的前体核苷酸，而前者是DNA糖基化酶的底物。通过糖基化酶切下经修饰的碱基之后，裂解所得的脱碱基位点并分析裂解产物。该方法可以检测候选基因座中的突变。然而，WO 97／03210的方法具有某些局限性。例如，使用此方法，不检测序列相似性就不可能检测核酸分子之间的序列差异，因此就不能混合多个样品以同时进行分析。

发明内容

本发明提供了鉴定核酸分子的方法，所述方法包括步骤：

ⅰ)将可用作DNA糖基化酶之底物的经修饰碱基导入DNA分子；

ⅱ)利用所述的DNA糖基化酶切下经修饰的碱基以产生脱碱基位点；

ⅲ)裂解脱碱基位点处的DNA以产生可被延伸的上游DNA片断；和

ⅳ)在可使片断延伸的酶和模板核酸的存在下保温可延伸的上游片断并分析所得的片断。

本发明使用上述可延伸的上游DNA片断提供了新的，通用的和简单的方法，所述方法可鉴定核酸，并如下文所述具有优于现有方法的优点。

本发明方法的最重要的用途(但不是唯一的用途)之一是扫描或检查DNA片断(靶核酸)中是否存在突变。该方法实质上由下列步骤组成：ⅰ)产生可延伸的上游DNA片断和ⅱ)随后使用这些片断分析一段DNA序列(如检测突变)。

优选所用经修饰碱基为尿嘧啶，次黄嘌呤或8-OH鸟嘌呤。

优选经修饰碱基得自经修饰的前体核苷酸，当其掺入DNA时即可产生所述经修饰碱基。

因此，优选的经修饰前体核苷酸是dUTP，dITP和8-OH dGTP，当其掺入DNA时即可分别产生糖基化酶底物碱基尿嘧啶，次黄嘌呤或8-OH鸟嘌呤。每个经修饰的前体核苷酸都是含有所述碱基和糖磷酸组成成分的碱基糖磷酸。DNA中的尿嘧啶由尿嘧啶DNA-糖基化酶(UDG)特异性识别并从DNA上释放。UDG也识别DNA中存在的其它尿嘧啶相关碱基。次黄嘌呤由烷基嘌呤DNA-糖基化酶(ADG)特异性识别并从DNA上释放。该酶也识别并释放DNA中存在的N3甲基腺嘌呤，N3甲基鸟嘌呤，O²甲基胞嘧啶和O²甲基胸腺嘧啶。8-OH鸟嘌呤由甲酰胺基-嘧啶DNA糖基化酶(FPG)特异性识别并从DNA上释放。该酶也识别并释放DNA中存在的开环嘌呤。胸腺嘧啶DNA糖基化酶识别并释放DNA中位于鸟嘌呤碱基对面的尿嘧啶和胸腺嘧啶。

本文所用的经修饰的前体核苷酸指的是一个或多个经修饰的核苷酸，可将该核苷酸掺入核酸以产生一个或多个可被DNA糖基化酶识别和切下的经修饰碱基。

导入经修饰碱基之后，用适当的DNA糖基化酶处理DNA产物，所述酶可识别并释放靶样品中存在的糖基化酶底物碱基，随后根据经修饰碱基的特性产生脱嘌呤或脱嘧啶(AP)位点。术语“AP位点”指的是DNA中已缺失或除去核苷酸的碱基组成成分，而具有DNA磷酸二酯骨架的脱氧核糖磷酸仍旧完好无损的位点。AP是脱嘌呤和／或脱嘧啶的缩写，具体取决于核糖环上结合的是嘌呤还是嘧啶碱基。AP位点也被称为脱碱基位点，为脱嘌呤和脱嘧啶位点的通称。

从核酸样品上释放糖基化酶底物碱基导致产生例如脱嘧啶位点(对尿嘧啶而言)和脱嘌呤位点(对次黄嘌呤和8-OH dG而言)。将所述位点通称为脱碱基位点。

实质上，裂解片断的3’末端必须具有羟基，必须不能以防止片断由所述3’末端开始延伸的方式保护紧接所述3’末端下游的DNA。产生的裂解片断的3’末端具有羟基，除去了防止片断由所述3’末端开始延伸的下游保护基，将衍生得到可延伸片断的DNA用作模板。

下文将要详细描述的是：可以多种方式裂解脱碱基位点的DNA以产生所述的上游DNA片断。

例如，可通过选自用碱性溶液或其它化学物质处理，热处理和／或用酶处理的方式裂解脱碱基位点处的磷酸键。