[发明专利]直接快速分析微生物所含生化成分的方法与其组成

说明书

此项发明是针对微生物所含生化分子的直接快速分析的创新，它能够避免分析这些生化分子之前的提取纯化的过程。

长期以来，人们一直是通过分析它们的生化成分来研究和定性微生物，其中DNA(脱氧核糖核酸)、RNA(核糖核酸)、脂肪、蛋白、糖或无机物之类需要预先进行提取、纯化。提取纯化过程，尤其是操作大量样品时，通常是人力和时间花费最多的一个步骤，除此之外，这个过程还需要用到有害试剂，产生有毒废物，这些有毒废物的处理和丢弃又花费昂贵。

举例来说，在细菌中一个含有插入片段的质粒要通过少量制备分析来筛选和确定(Ausubel et al(1989)Current Protocols in Molecular Biology.Vol 2，John Wiley& Sons，New York)。这个过程需要将转化过的细菌在液体培养基中培养一夜，第二天再将质粒DNA提取纯化出来。通常小规模质粒DNA制备包括离心，苯酚和氯仿萃取和沉淀多种步骤。纯化过的DNA通常是要先用限制性内切酶消化，然后进行电泳分析以对质粒中所含插入片段定性，这种少量制备需要至少两天的时间和人力，需要用到苯酚、氯仿之类的有毒有机物，实际上，分析所需DNA只占总制备量的百分之十。

最近一个关于小量制备质粒DNA的报道说，用改进的碱性裂解方法处理转化过的细菌来释放DNA质粒，可以在常规纯化过程的中途分析超螺旋结构的质粒，虽然这是对小量制备的一个改进，但其不足是，细菌的过夜培养，质粒的提取纯化，以及用限制性内切酶分析来确定结果这些步骤仍是不可避免(Biao et al.，BioTechniques 23：601-607(1997))。

另外一种用来筛选确定重组菌株的方法是PCR-多聚酶链反应(Costa and Weinter，Strategies 7：35-37(1994))。这种方法不需要在液体培养中生长过夜细菌，转化培养皿上的菌株克隆可以直接用PCR检侧DNA质粒。如果质粒中含有插入片段，PCR结果就会有一条适当大小的产品。这种方法看起来似乎方便快速，但却仍然存在不少问题，例如每种质粒都要事先做多次实验来找出最佳所用引物，此过程耗费人力物力，如果插入片段比较长的话，PCR结果就不一定可靠，会含有很多杂的其它不需要的基因产品。

筛选大量数目的重组细菌克隆还可用克隆杂交和放射性自显影的方法(Sambrook etal，(1989)Molecular Cloning：A laboratory Manual，2nd ed，CSH Laboratory Press.Cold Spring Harbor，NY)。然而这些方法涉及到安全，环境保护和费用问题，已逐步不再作为日常研究使用的最佳方法。

总之，所有类似以上所提到的有关分析DNA的方法，RNA、蛋白、脂肪或微生物所含其它非核酸成分的各种分析方法都需要提取和纯化这个耗费人力物力的步骤。

因此，人们对发展能够从微生物中不需要提取纯化而直接分析它们的生化成分的新方法有浓厚兴趣，并且，如果这些新方法能够避免使用有害物质，将会引起更广泛的兴趣。

此项发明是根据一个微生物克隆含有足够可以用凝胶电泳检测的DNA、RNA、蛋白质等生物物质的事实，描述了一个不需要事先提取纯化就可以直接分析微生物克隆所含细胞物质的实验方法和步骤。这个新方法大量提高了现有的分析检测细胞成分的能力，使得整个过程简捷快速准确。

此项发明描述从微生物中直接快速分析其细胞成分的方法和步骤。用这种方法分析细胞成分不需要分析前的提取和纯化，因此可以用于大量样品的分析和获得准确的结果。

此项发明的一个内容是不用事先将核酸与其它细胞物质分离而可以检测到核酸的存在，其中包括：

(a)将微生物悬浮于含0.1％(体积/体积)-5％(体积/体积)非离子去污剂的溶液中形成第一悬浮液，其中去污剂的作用是将微生物溶解以释放出所需要核酸；

(b)将第一悬浮液在65℃以上的温度范围内加热至少10秒钟；

(c)将第一悬浮液和含限制性内切酶的溶液合并而形成第二悬浮液，其中的限制性内切酶用以消化核酸分子；

(d)检测第二悬浮液中核酸分子的存在。

此项发明的另一个内容包括：

(a)将微生物悬浮于含(i)0.1％(体积/体积)-5％(体积/体积)非离子去污剂和(ii)限制性内切酶的溶液中，其中去污剂令微生物溶解并释放出核酸，而限制性内切酶紧接着会把释放出的核酸切断；

(b)检测第二悬浮液中核酸分子的存在。

此项发明还有一个内容包括：