[发明专利]真菌细胞壁结构性多糖的制备方法

说明书

本发明涉及用作吸附带负电物质、吸附重金属离子和用作生物体的吸附固定化载体的真菌细胞壁结构性多糖及其制备方法。

几丁质或壳聚糖是结构类似于纤维素的胺基多糖生物聚合物，由于它们具有丰富的自由胺基和凝胶性的特性，被广泛用作生物吸附剂，重金属离子吸附剂和包埋固定化载体，其不足之处在于：几丁质含自由胺基含量少，吸附量小，性能差于壳聚糖；但壳聚糖易溶解于有机溶剂和酸性溶液，故作为生物吸附剂，其操作稳定性较差，也无法再生利用；在用作重金属离子吸附时，为提高操作稳定性，需通过交联或螯合，虽可使稳定性有所提高，但同时也失去了部分自由胺基，致使吸附量下降，还增加了成本；而利用凝胶性，用作酶、微生物或动植物细胞的包埋固定化载体，存在着传质阻力大，不利于氧和其他营养物质的及时供应(Scott，R.T.et al，Enzyme Micro.Technol.，10：151-155，1988)，固定化细胞内的细胞增殖会使固定化细胞破裂，导致细胞渗漏等缺点；此外，几丁质或壳聚糖大都从虾蟹等甲壳纲动物的壳中制备而得，不仅原料来源受虾、蟹生长周期、季节、气候条件、捕捞量等因素制约，且在制备过程中需强酸强碱以及高温的作用，耗能巨大还会造成环境污染。

鉴于上述，本发明的目的是提供一种吸附量大、吸附力强、不溶于酸碱、稳定性好、易再生的真菌细胞壁结构性多糖。

本发明的另一个目的是提供一种制备本发明的真菌细胞壁结构性多糖的方法。

本发明还有一个目的是将本发明的真菌细胞壁结构性多糖作为生物吸附剂、重金属离子吸附剂和生物固定化载体的应用。

本发明的真菌细胞壁结构性多糖是以含壳聚糖或几丁质的真菌菌丝体为原料，用下述方法得到：

1)对真菌菌丝体进行物理破碎、水洗，去除胞内原生质；

2)醇洗，除去细胞壁上的类脂；

3)用碱溶液或酶除去细胞壁上的蛋白质及核酸；

4)用双官能团试剂进行交联反应，然后用有机溶剂或水溶剂去除交联剂；得到在中性或酸性溶液中呈正的表面电势的真菌细胞壁结构性多糖。这种真菌细胞壁结构性多糖以胺基已糖—葡聚糖为主，通常，为使其具有好的吸附性能，而使它的自由胺基含量不低于0.8％(重量)为好，折合成胺基己糖(几丁质或壳聚糖)不低于8％(重量)。

本发明提供的制备真菌细胞壁结构性多糖的方法是，以含壳聚糖或几丁质的真菌菌丝体为原料，包括以下步骤：

1)对真菌菌丝体进行物理破碎、水洗，去除胞内原生质；

对于真菌菌丝体，一般来讲，真菌细胞壁通常含胺基己糖(壳聚糖和几丁质)，但以接合菌纲(如毛霉属、犁头霉属、根霉属)、子襄菌纲(黑曲霉、青霉)、担子菌纲和半知菌纲真菌细胞壁为多，其它真菌则含量较少。这些真菌可以按普通培养法进行液体悬浮培养。培养基可以是天然的(土豆汁培养基)，也可以是半合成的(蛋白胨或牛肉浸膏等加葡萄糖或蔗糖)，亦可以是完全合成培养基(碳源以葡萄糖或蔗糖或糖蜜为主，氮源以硝酸铵或硫酸铵或硝酸钠为主，再加维生素)。在温度32～37℃，通气量0.5～2.0vvm及转速300～500rpm的通气搅拌罐中，经过3～5天的培养，菌丝体得到大量繁殖。用金属丝网收集发酵液中的菌丝体。此菌丝体可用作细胞壁的原材料。当然，亦可直接采用工厂出来的真菌(如黑曲霉、米根霉及青霉等)菌丝体废料。

物理破碎可采用传统的机械法，如研磨，沙振动及高速剪切法，也可以采用超声波法及冷冻破碎法。破碎程度以100微米以下为好，这样能保证以后物化处理的完全性。破碎以后，菌丝体用水冲洗，使原生质去除干净。

2)醇洗，除去细胞壁上的类脂；

醇可以采用50％(v/v)的甲醇、乙醇，但以乙醇为优。去类脂效果以温度选在40～60℃，搅拌速度选在200～500rpm为好。

3)用碱溶液或酶除去细胞壁上的蛋白质及核酸；

碱溶液是可溶性的氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钙或氨水。所用碱浓度取决于具体的真菌种类。对于根霉、梨头霉及毛霉，碱浓度以0.2～2.0N为优，而对于曲霉及青霉，碱浓度以2.0～6.0N为优，一般也以温度选在40～60℃，搅拌速度选在200～500rpm为好。若采用酶，则可用蛋白酶来除蛋白质，核酸酶来除核酸。

4)用双官能团试剂进行交联反应，然后用有机溶剂或水溶剂去除交联剂；这样就可使自由壳聚糖结合于网状的细胞壁结构性多糖络合物上。