[发明专利]糖尿病鉴别试剂盒及其制作方法

说明书

糖尿病鉴别试剂盒及其制作方法，涉及利用卡介苗(BCG)65KD热休克蛋白作为抗原，运用ELISA法检测糖尿病患者血清中64KD抗体，在临床上鉴别诊断糖尿病型别的一种试剂盒及其制作方法。

目前临床上鉴别糖尿病的指标主要有胰岛细胞抗体(ICA)，胰岛素自身抗体(IAA)，以及64KD抗体。ICA和IAA存Ⅰ型糖尿病患者血清中阳性检出率低，发病后检出率下降，并且ICA和IAA还存在于其他内分泌疾病；所以临床上未能推广应用。检测64KD抗体在现有技术中有运用谷氨酸脱羧酶(GAD)作为抗原，因价格高昂，难以推广到临床使用。本发明的检测64KD抗体的ELISA试剂盒及其制备方法是生产出一种新技术产品的新的技术方法。用本发明制备的检测64KD抗体(65KDHSP抗体)试剂盒检测了30例Ⅰ型糖尿病，30例Ⅱ型糖尿病，5例系统性工斑狼疮，8例甲亢，44例健康人，64KD抗体阳性检出率分别为83．3％，13．3％，0．00％，0．00％，2．27％；24例64KD抗体阳性的Ⅱ型糖尿病有22(91．7％)例需要胰岛素治疗，所以从Ⅱ型糖尿病中可识别出成人迟发性自身免疫性糖尿病。对Ⅰ型糖尿病诊断的特异性为94．6％，诊断的敏感性为83．3％，诊断指数为177．9％。

本发明的目的在于提供一种以卡介苗(BCG)65KD热休克蛋白作为抗原，并以ELISA法检测糖尿病患者血清中64KD抗体的试剂盒，用于临床上鉴别诊断糖尿病型别；此试剂盒不仅能诊断Ⅰ型糖尿病，而且能从Ⅱ型糖尿病中识别成人迟发性自身免疫性糖尿病(LADA)。抗原卡介苗(BCG) 65KD热休克蛋白制备简单，成本较低。

本发明的试剂盒及其制备方法的技术方案如下：

1)制备卡介苗(BCG) 65KD热休克蛋白

BCG接种于培养基中培养10～14天，设备使用恒温振荡培养箱，(上海跃进医疗器械二厂)容量500ml三角烧瓶9个；

在恒温水浴箱(型号：ZB11241-89)中，40～45℃水浴1～4小时；

用离心机(北京医用离心机厂产LD4-2型)收集上清液；

用硫酸胺沉淀法浓缩蛋白质，浓度为1～500mg／ml；

用蛋白质回收槽(北京六一仪器厂产DYY-Ⅲ43型)纯化，或者用Waters层析仪(层析法)纯化卡介苗(BCG)65KD热休克蛋白；

用SDS-PAGE法鉴定其分子量，用免疫动物(家兔或小白鼠)鉴定其免疫(抗原)活性；

合格后即生产出本发明所需用的卡介苗(BCG)65KD热休克蛋白；数量为每人每月制备大约0．5克；三人合作大约每月制备3克。

2)制备酶联反应板

将卡介苗(BCG) 65KD热休克蛋白用PH(8-10)的碳酸盐缓冲液定量至1μg～1000μg／ml；

包被酶联反应板0．1～50μg／孔；

用含1～5％BSA(小牛血清白蛋白)的磷酸盐缓冲液封闭，封闭条件是37℃下1小时，或4℃下12小时；

洗涤；洗涤液为含0．1％的吐温-20的PH7．4，0．01mol／L磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5分钟；

经自然干燥，用聚氯乙烯塑料袋消毒密闭封装，在4℃下保存备用；

1克卡介苗(BCG)65KD热休克蛋白可包被10万人份。

3)制备试剂盒

已包被卡介苗(BCG)65KD热休克蛋白的酶联反应板，板型两种：可拆96孔或可拆48孔；

HRP-羊抗人IgG(辣根过氧化物标记的羊抗人IgG)，1∶800稀释，管装两种规格：15μl或7．5μl；

洗涤液，瓶装30ml或15ml，20倍浓缩含0．05％的吐温-20的PH7．4，0．01mol／L磷酸盐缓冲液；(使用时稀释20倍)

酶标抗体稀释液；(洗涤液加1％～2％的小牛血清白蛋白200μl)

底物稀释液；(0．1mol／L的磷酸氢二钠10．28ml加上0．05mol／L枸橼酸9．72ml)

底物OPD；(邻苯二胺，片状， 3片，进口产品，Sigma公司出品)

终止液2mol／L硫酸；

阳性血清，50μl。

本发明用于临床检测64KD抗体过程：

1)酶联反应板加待检血清(1∶10)-(1∶100)100μl，37℃孵育1小时，洗板；

2)加HRP标记的抗人IgG(军事医学科学院产品)，37℃孵育1小时，洗板；

3)加底物OPD液100μl，37℃闭光显色10～20分钟；

4)加终止液2mol／LH₂SO₄ 50μl；