[发明专利]一种新酶源的醇腈裂解酶催化合成光学活性氰醇化合物的方法

说明书

本发明涉及一种醇腈裂解酶，系采用桃仁、枇杷或大巢菜种子为新酶源制得的粗醇腈裂解酶，该酶可催化合成光学活性氰醇化合物。

氰醇化合物是重要的有机合成中间体，可以方便地转化成α-羟基酮、α-羟基酸、β-胺基醇、胺基腈和氮丙啶等化合物。无酶催化条件下化学合成产物是外消旋的氰醇化合物，由于酶对反应的高度化学、区域和立体的专一性以及酶反应条件温和，已从化学合成发展为酶催化合成光学活性氰醇化合物。杏仁(Almond)是一个方便的酶源，由杏仁源制得的R-氰醇裂解酶[(R)-oxynitrilase]催化合成光学活性氰醇化合物已进行了研究(Griengl，H等，J.Chem.Soc.，Chem.Commun.1997，1933)，用粗制酶和纯酶的R-氰醇裂解酶催化反应已有报导(Kiljunen，E等，Tetrahedron，Asymmetry，1996，7.1105；1997，8，1225；1997，8，1551；Effenberger，F.Angew.，Chem.Int.Ed.Engl.，1994，33，1555；Enantiomer.，1996，1，359)。通常水相缓冲液作为满意的反应条件(Brussee，J等，Tetrahedron，1990，46，979)以及后来发展的水-有机溶剂两相反应体系。由于羰基化合物和酶分别具有亲油性和亲水性，在油水两相反应中反应不均匀，且水相中易产生化学加成的消旋产物而导致产物ee值低，纯化困难，难以工业化生产，林国强等人采用杏仁作为酶源制得粗醇腈裂解酶，并用该酶在有机溶剂或含微水的有机溶剂体系中催化合成光学活性氰醇化合物，发展了连续流动相酶催化反应工艺，更适合工业化生产的需要(CN98110818.0)，除苦杏仁外，还报导高梁秧苗(Tetrahedron Lett，1990，31，1249)，橡胶树(Tetrahedron Lett.，1993，34，4769)，木薯(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1996，35，4)，苹果、李和樱桃种子(TetrahedronAsymmetry，1997，8，1551；1997，8，1225)作为酶源的醇腈裂解酶合成手性氰醇。虽然在醇腈裂解酶催化合成手性氰醇领域的研究很热，但是用于手性氰醇的生产还有不少问题有待解决，还需不断探索新酶源及其工业化生产的方法。

本发明的目的是提供一种从新酶源获得的醇腈裂解酶。

本发明的另一目的是提供一种由新酶源获得的醇腈裂解酶的用途，即合成手性

本发明的另一目的是提供一种由新酶源获得的醇腈裂解酶的用途，即合成手性氰醇化合物及其方法。

根据中医药学理论以及氰甙具有毒性这一特征，对近百种有毒性或具有镇咳却痰功效作用的植物细胞进行了调查和试探，并从中选择了几种植物细胞作为酶源进行了详细考察，获得几种可作为醇腈裂解酶的新酶源。

本发明的醇腈裂解酶系采用桃仁Peach(Prunus persica L.)、枇杷Loquat(Eriobotrya L.)或大巢菜(Vicia Sativa L.)的种子作为新酶源，经破碎、有机溶剂脱酯后获得醇腈裂解酶。也可以经破碎、水溶性溶剂浸出或提取、浸出液或提取液经浓缩，或者浸出液或提取液经透析或柱层析分离后再浓缩或有机溶剂提取后再浓缩而制得。所获的醇腈裂解酶可以是粗产品。

所述的桃仁、枇杷或大巢菜种子通常经洗净、晾干、除皮，采用组织破碎机粉碎，用1-3倍量的有机溶剂脱除脂质物质1-3次，经50-200目筛获白色或微黄色粗酶粉。该酶粉经干燥处理通常含水8-10％，置于冰箱中贮存。

或者经破碎后，用水溶性溶剂如磷环-柠檬酸钠缓冲液、醋酸-醋环钠缓冲液，咪唑-盐环缓冲液中在0-20℃下均化匀浆、过滤。浸出或提取液经离心处理，浸出或提取液浓缩；或者浸出或提取液经透析离子交换柱层析或柱层析凝胶分离后再浓缩可制得醇腈裂解酶。

所述的有机溶剂是低碳链的脂、醚、醇、芳烃，取代芳烃、烷烃、卤代烷或二甲基甲酰胺等。

所述的水溶性溶剂可以是pH3-6.5的无机盐或有机盐水溶液或缓冲液，或上述溶液与水溶性有机溶剂的混合液。