[发明专利]非同步链延伸聚合酶链反应

说明书

本发明涉及一种正负两条链非同步合成的DNA体外扩增技术。

在现有的DNA体外扩增技术中，聚合酶链反应(polymeras chain reaction，PCR)是最主要也是最有效的技术。该技术系将含有耐热DNA聚合酶、特异性引物、dNTP底物、模板DNA、镁离子等的反应体系反复进行高温模板变性、低温引物与模板结合、中温引物延伸的热循环，而使靶DNA片段在体外得到扩增。但在扩增较大拷贝数的重复序列时，由于重复序列模板很容易发生退火，常规PCR很难获得满意的扩增结果。首先是扩增效率低，一般的检测手段如溴乙锭染色或银染难以检测，其次是容易出现多条影子带，影响扩增结果的判定。我们认为这主要是由于重复序列在低温和中温时很容易相互退火，影响了新链的合成过程和合成效率造成的。目前尚未见从根本上解决这一难题的办法。

本发明目的在于提供一种操作简单，能够有效扩增较大拷贝数的重复序列的DNA体外扩增技术。

本发明非同步链延伸聚合酶链反应(asynchronous strand-extension polymerase chain reaction，ASE-PCR)首先根据待扩增的靶DNA序列合成一对特异性的单链引物，这一对引物界定要扩增的靶DNA片段，再根据要扩增的重复序列合成一段15-20碱基的重复序列，并在其3’-末端进行加双脱氧核苷酸或磷酸化修饰，使其失去延伸能力，记作寡重复序列(oligo-repeat sequence，ORS)。将ORS、引物、耐热DNA聚合酶、dNTP底物、模板DNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水等混匀成反应体系，在热循环仪上进行高温、低温、中低温、中温的反复热循环。反应体系处于高温时，模板DNA变性；体系降到低温和中低温时，引物与特异的靶DNA结合引导新链的合成，同时，ORS与其互补链的重复序列退火，从而抑制模板之间的重复序列相互退火。中低温时未与ORS结合的链能够作为模板首先指导合成完整互补新链；与ORS结合的链则在重复序列区新链延伸受阻，不能合成完整互补新链。中温时ORS从与其结合的模板链上脱离下来，该模板此时则可以指导合成完整互补新链。这样经过25-35个热循环后，就能获得上百万拷贝的特异的含重复序列的靶DNA片段。

下面以扩增脆性X智力低下1号基因(fragile X mental retardation 1，FMR1)的5’非翻译区为例来进行详细说明。

首先根据FMR1的序列(GenBanK S74494和Nature Genet，8(1)88-94，1994)合成一对FMR1特异的正引物FF：5’-GTTTCGGTTTCACCTTCCGGTGGAGG-3’，FR：5’CCTCCATCTTCTCTTCAGCCCTGC-3’；再合成寡重复序列并在其3’-末端进行磷酸化或加双脱氧核苷酸修饰：5’-CGGCGGCGGCGGCGGCGG-3’，记作ORS

混合50ul反应体系，内含两引物各20pmol，寡重复序列ORS100pmol正常人DNA 50-100 ng，1XPCR缓冲液，Taq DNA聚合酶2u，^Mg++终浓度2mmol／L，在96℃下变性5分钟，然后在PE9600上按96℃20秒，56℃30秒，65℃30秒，75℃1分30秒下循环35次，2％琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察，可以发现预期大小的DNA条带。

上述反应体系中，反应体系处于高温时，模板DNA变性；体系降到56℃和65℃时，引物与特异的靶DNA结合引导新链的合成，同时，ORS与(GCC)n重复序列退火，从而抑制模板之间的重复序列相互退火，使未与ORS结合的(CGG)n链能够作为模板首先指导合成完整的互补新链；与ORS结合的链则在重复序列区新链延伸受阻，不能合成完整互补新链。75℃时ORS从(GCC)n模板链上脱离下来，使该模板此时可以指导合成完整互补新链。这样经过25-35个热循环后，就能获得上百万拷贝的特异的含重复序列的靶DNA片段。