[发明专利]抗HPV16E6核酶质粒及其在人乳头瘤病毒与肿瘤治疗中的应用

说明书

本发明涉及含抗HPV16E6核酶基因的真核表达质粒，可用于人乳头瘤病毒及其相关肿瘤，如宫颈癌、口腔癌、喉癌等的治疗。

目前所知，人乳头瘤病毒(HPV，Human Papillomaviruses)是人类肿瘤病毒病因中最为重要的一类病毒。高危HPV易引起恶性肿瘤，与宫颈癌、阴茎癌、口腔癌、喉癌及皮肤癌等发病密切相关，其中最常见的类型是HPV₁₆和HPV₁₈。核酶(Ribozyme)是指有催化活性的RNA分子，它可以有效地、序列特异地切割靶RNA。由于Ribozyme可以序列特异性地切割靶RNA，从而可以在mRNA水平阻断靶基因的表达。研究已表明，HPV的致癌性主要与其E₆、E₇基因有关。因此本研究设计、合成了抗HPV16E6核酶，其靶位点是HPV16E6基因上的第170位点，并将其克隆于真核表达质粒PcDNA3中。目前国内外尚未见有关抗HPV16E6核酶的研究报道。

本发明的目的是提供一种可用来治疗和研究人乳头瘤病毒及其相关肿瘤的含抗HPV16E6核酶基因的真核表达质粒。

我们以HPV16E₆基因为靶基因，设计了能特异切割它的核酶，并进行了克隆、表达与活性鉴定；证实该抗HPV16E₆核酶能有效地、序列特异地切割HPV16E₆mRNA。质粒可应用于人乳头瘤病毒及其相关疾病，如宫颈癌、喉癌、口腔癌等，的治疗与研究。细胞和动物实验证实，抗HPV16E₆核酶能在RNA水平阻断HPV16E₆基因的表达，阻断HPV相关肿瘤的细胞周期进展，诱导肿瘤细胞凋亡，部分逆转宫颈癌等肿瘤的恶性表型，因此可用于宫颈癌、口腔癌、喉癌等肿瘤的治疗。另一方面以核酶为研究工具，通过阻断癌基因的表达，可研究细胞癌基因、抑癌基因、信号转导机制的变化，从而深入探讨HPV的致癌机制。

抗HPV16E₆核酶质粒的有效浓度0.1ug/ul-100ug/ul，最佳浓度0.1ug/ul-10ug/ul.

本发明的来源：

(1)设计：以HPV₁₆基因序列为分析序列，采用计算机软件针对HPV16E6基因设计特异性锤头状核酶。

(2)人工合成了抗16HRz ribozyme基因(各两条链)，并引入酶切位点，以便于克隆组装。A.5’CTAGATATCATGTACTGATGAGTCCGTGAGGACGAAAGTTGTTTGGGTAC3’

   Xba I                                        Kpn IB.5’CCAAACAACTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGTACATGATAT3’

(3)将抗16HRz ribozyme基因装入原核表达质粒中，进行核酶的体外切割实验，而后又将核酶基因装入真核表达质粒(PcDNA3)中，构建成抗HPV16E₆核酶质粒。该质粒借助于脂质体或病毒载体等的携带，用于人乳头瘤病毒及其相关肿瘤，如宫颈癌、喉癌、口腔癌等，的治疗与研究。

以下所述的实例详细说明了本发明实施例1实验材料：1.pc16Rz、pcDNA3质粒的制备：pRSV-Rz523为抗HPV16E6核酶的真核表达质粒，pcDNA3为无目的基因的真核表达质粒，将其转化JM105受体菌，大量制备并纯化。2.CaSKi细胞、HL60细胞、K562细胞的培养：CaSKi细胞为HPV16阳性的人宫颈癌细胞株：HL60细胞为人粒细胞白血病细胞株，系NK抵抗细胞；K562细胞为人红白血病细胞株，系NK敏感细胞。以上三种细胞均由本室传代培养。3.动物：4周龄裸鼠，雌性，体重20-26克，由第一军医大学动物中心提供。4.主要试剂：G418，MTT，HPV16E6单抗，FITC标记的bcl-2、c-myc、fas、p-53单抗。实验方法：

1.转染CaSKi细胞：以脂质体法将浓度为10ug/ul的pc16Rz、pcDNA3分别转染CaSKi细胞，通过G418(400ug/ml)抗性筛选，将阳性克隆细胞扩增并保存，分别命名为CaSKi-R、CaSKi-P细胞。以RNA点杂交法检测抗HPV16E6核酶在CaSKi-R、CaSKi-P细胞中的表达，结果证实抗CaSKi-R细胞中能稳定表达。