[发明专利]GFP－TNF－α融合蛋白原核表达系统构建及产物和应用

说明书

本发明涉及一种自动发光蛋白基因表达载体的构建极其表达产物和该表达产物在生物活性因子免疫性检测，特别是在检测肿瘤坏死因子(TNF)受体含量、分布，和检测体液、细胞培养上清中TNF-α水平及可溶性TNF受体(sTNFR)含量中的应用。

人体内许多生物活性因子(包括部分外源性病原)都是通过与靶细胞受体结合，进而发挥生物学效应的，以调节机体的各种生理功能。因此，检测这些因子与相应受体的亲和力，和这些受体在组织器官的分布，以及其在病理情况下的改变，对了解生理功能和病理变化机制都具有十分重要的意义。长期以来，人们使用同位素标记配体，来检测受体的量，做配体与受体亲和力检测，一直沿用至今。尽管同位素法敏感，但同位素对唤境污染和对人体的损害，迫使人们寻找非同位素标记物(如地高新，生物素等)取代，但多用于检测可溶性因子，而对于配体一受体结合实验，由于受定量较难等各种因素的限制，仍保留原检测方法。

绿色荧光蛋白(GFP)源自海洋生物水母，能够发射最大波长为509nm，最大吸收波长为395nm，并在475nm还有一个肩峰。GFP具有下列优点：分子量小，无细胞毒性，不干扰标记蛋白的功能和定位，是目前唯一能在异源细胞内表达并自发产生荧光的蛋白，无需辅助因子的参与，可进行活体检测。由于上述原因，GFP被认为是一种理想的报道基因，是研究细胞基因表达和表达产物分布的最好工具。目前，含GFP真核表达载体已经商品化。

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一个具有广泛生物学效应的细胞因子，其参与免疫调节，炎症反应，抗肿瘤，组织修复等生理和病理过程。大量TNF-α的产生，可引起内毒素样休克，发热，多器官功能衰竭等，慢性可引起恶液质。TNF-α发挥其功能需要首先与TNF受体结合，在内毒素性休克和一些炎症疾病时，TNF-α及其可溶性受体明显增高，并与某些疾病的预后有明显关系。

本发明的目的是构建绿色荧光蛋白(GFP)基因与人分泌型肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因融合体，使该融合体在大肠杆菌中表达的融合蛋白质既有TNF-α的抗原，又能发射易于检测的绿色荧光。

本发明的另一个目的是提供一种利用本发明重组载体表达的既有TNF-α的抗原，又能发射易于检测的绿色荧光的融合蛋白，替代同位素检测法，检测肿瘤坏死因子(TNF)受体含量、分布，和用于检测体液、细胞培养上清中TNF-α水平及可溶性TNF受体(sTNFR)含量，使其具有特异性强，灵敏度高，重复性好，操作简便快速，利于环保，有利人体健康，成本低，费用少，有利于减轻患者经济负担等特点。