[发明专利]含有粒细胞集落刺激因子和多糖的复方胶囊

权利要求书

1、一种含有粒细胞集落刺激因子和多糖的复方胶囊，其特征在于它由平均分子量为1300-1500的小分子牛膝多糖，从羊胚胎组织水解得到18种人体必需的氨基酸成分，由羊胚胎组织经组织细胞培养技术获取集落刺激因子，冻干羊胚胎粉组分组成，由该组分制作的每粒胶囊250mg内含牛膝多糖125mg，冻干羊胚胎粉119mg，羊胚胎水解物5mg，羊胚胎组织培养冻干粉1mg。

2、根据权利要求1所述的含有粒细胞集落刺激因子和多糖的复方胶囊，其特征在于羊胚胎粉由羊胚胎经消毒、捣碎、去脂、冻干、球磨等工艺制成＞200目的粉末。

3、根据权利要求1所述的含有粒细胞集落刺激因子和多糖的复方胶囊，其特征还在于羊胚胎水解物包含18种人体所必需的氨基酸，它们是色氨酸、丝氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、门冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸。

4、根据权利要求1所述的含有粒细胞集落刺激因子和多糖的复方胶囊，其特征在于粒细胞集落刺激因子提取的方法如下：

1)将重量50-200g/只的新鲜羊胚胎，经碘酒与酒精消毒后，用手术剪切开胚胎皮肤，暴露胚胎实质器官，分别将各脏器切成1.0cm×1.0cm组织块；

2)组织块置于组织细胞培养瓶中，每瓶子10g，内含RPMI1640培养液和胎牛血清，置二氧化碳培养箱内，37℃、5％CO₂、饱和湿度环境下进行培养，每24小时轻轻摇动培养瓶；

3)7-10天后取出，经3000rpm/30′离心、弃沉淀，超滤除菌后置4℃保存，此为羊胚胎组织制得的天然粒细胞集落刺激因子粗制品；

4)粗制品用XHP-1超滤膜在SS-3超滤器上纯氮正压过滤，使之浓缩至原液的1/4体积，用0.02mol/L，pH6.4的醋酸缓冲液透析48h，透析后逐滴加入冰醋酸，调pH至4.0，3000rpm离心15分钟，收集上清液；

5)羧甲基纤维素CM52常规处理后置于pH4.0的缓冲液，含0.2g/L NaN3和0.05g/L PEG6000，平衡24h，装压2.6cm×30cm层析柱，用同种缓冲液平衡10h，将上清液装柱，分别用pH4.0pH5.0及pH6.0的醋酸铵缓冲液，含0.2g/L NaN3和0.05g/L PEG6000，阶段洗脱，流速为60mL/h；

6)在pH5.0及pH6.0的缓冲液洗脱时，分别出现一个蛋白峰，收集蛋白峰，测活性，将上述活性峰浓缩，上Sephaclex G-75柱，已用pH7.40.01mol/L，PBS平衡，柱大小为1.6cm×90cm，用平衡缓冲液洗脱，洗速为12ml/h，可各得粒细胞集落刺激因子蛋白峰；

7)活性检测应用骨髓细胞集落形成试验，即首先用含有10％FCS的RPMI-1640培养液，制备0.3％-1.4％的软琼脂，铺在无菌平皿内，再用淋巴细胞分层液分离正常人骨髓单个核细胞，以2×10⁵/ml细胞接种于软琼脂中，37℃、5％CO₂和饱和湿度中培养12-14天，在显微镜下计数≥40个细胞集落形成数。