[发明专利]系列通用型腺病毒伴随病毒载体的构建及用途

说明书

生物技术发明领域

基因治疗是20世纪90年代发展起来的一种全新的疾病治疗模式，它通过向人的体细胞导入治疗基因发挥对疾病的治疗作用。目前，全世界已有三百多个基因治疗的临床方案获得批准，数以千计的患者接收了临床试验。基因治疗的对象也从最初的遗传病、肿瘤逐步扩大到心血管病、感染性疾病等。随着研究的不断深入与完善，基因治疗必将在21世纪对临床医学产生巨大的推动作用。

将治疗基因导入人体细胞是基因治疗的必经步骤，而治疗基因需要合适的载体来运载。用于基因治疗的载体可分为病毒载体和非病毒载体两大类。2型腺病毒伴随病毒(adeno-associated virus type2，AAV-2)是一种复制缺陷性的微小病毒，由于具有对人类不致病、可感染有丝分裂后细胞、其基因组可定点整合至人19号染色体等特点，有望发展成为理想的基因治疗载体，因而在近年来的基因治疗研究中很受重视。制备携带外源基因的重组腺病毒伴随病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)的常规方法涉及两个质粒，一个是携带外源基因(即治疗基因)表达盒及AAV-2倒转末端重复序列(inverted terminal repeats，ITR)的载体质粒，其中的ITR是rAAV复制和包装所需的最短的顺式序列；另一个是含有AAV-2 rep和cap基因的助手质粒，可反式提供rAAV复制和包装所需的蛋白。将两个质粒一起转染细胞，再用辅助病毒(腺病毒或单纯疱疹病毒)感染，才能包装出含外源基因的rAAV假病毒颗粒。我们曾发明了一种用于rAAV大规模生产的全功能辅助病毒(已申报专利，申请号98120033.8)，简化了生产步骤并提高了产量。

制备rAAV的第一步需构建携带治疗基因的AAV载体质粒。目前，构建AAV载体质粒的常规方法需从含有AAV-2全基因组的质粒(如Sub201)入手，卸下其中的rep和cap基因，只保留两端ITR，再依次装入启动子、治疗基因和poly A信号，步骤繁琐，费时费力，亟待改进。

通过提供一系列通用型的AAV载体质粒及其构建方法、提供用这些通用型载体质粒构建携带治疗基因的AAV载体质粒方法，简化构建携带治疗基因的AAV载体质粒的步骤。

本发明涉及一系列通用型AAV载体的构建，这些载体包括pWAV-1、pWAV-2、pSNAV-1、pSNAV-2。其共同特征是每种载体均提供AAV-2两端的ITR、巨细胞病毒(CMV)立早增强子和启动子、多克隆位点和poly A信号。本发明提供了用上述通用型AAV载体构建携带外源基因的AAV载体质粒的方法。含有外源基因的AAV载体质粒既可用于产生重组AAV，又可直接作为真核表达质粒使用。pSNAV-1和pSNAV-2除具有上述共同特征外，还含有新霉素抗性基因表达盒。本发明利用这一特征，提供了用含有外源基因的pSNAV-1和pSNAV-2质粒建立稳定携带AAV载体的细胞株的方法。本发明进一步提供了“一株载体细胞/一株辅助病毒”的rAAV生产方法，即用我们先前发明的一种用于rAAV大规模生产的全功能辅助病毒(已申报专利，申请号98120033.8)感染AAV载体细胞株，实现重组AAV的大规模生产。

用于本发明的原始生物材料

pSub 201，为Samulski实验室赠送的含有AAV-2全基因组的质粒；

pUCMA，为本室先前构建的含有CMV立早增强子和启动子、多克隆位点及polyA的质粒；

tgCMV/HyTK，含有CMV立早增强子和启动子及其控制下的HyTK基因的真核表达质粒；

pAV53，为携带氨苄青霉素抗性基因和大肠杆菌复制起点的AAV载体质粒；

pSV2neo，为Promega公司生产的表达新霉素抗性基因的真核表达质粒；

pCMV-lacZ，为本室先前构建的含有CMV立早增强子和启动子及其控制下的β-半乳糖苷酶基因的真核表达质粒；

pCD2，含有CMV立早增强子和启动子及其控制下的大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因及SV40早期启动子控制下的新霉素抗性基因的逆转录病毒载体质粒；

以上质粒的宿主菌为Escherichia coli大肠杆菌MAX EFFICIENCY DH5α(GIBCO#18528-012)。

系列通用型AAV载体质粒的构建过程及特征

pWAV-1的构建过程及特征