[发明专利]醋酸杆菌的木糖醇脱氢酶及其基因

说明书

本发明涉及醋酸杆菌的一种新的木糖醇脱氢酶、编码此酶的基因以及生产木糖醇脱氢酶和木糖醇的方法。木糖醇在食品工业、医药工业等领域是很有用的。

木糖醇是一种天然糖醇，因为其含有较低的热量却具有与蔗糖相当的甜度，所以是一种有广阔应用前景的低热量甜料。此外，因为有抗龋齿的特性，其可以作为一种预防龋齿的甜料。另外，因为木醇糖并不升高葡萄糖的水平，因此被利用于糖尿病的流体疗法。由于这些原因，可以预计将来木糖醇的需求会增加。

目前木糖醇的工业化生产主要利用如美国专利4008285中公开的方法即D-木糖的脱氢来进行。D-木糖作为原料通常由植物材料如树木、稻草、玉米穗轴、燕麦壳和其它富含木聚糖的材料的水解作用而获得。

然而，这种由植物材料水解而获得的D-木糖因为成本高所以有价格较高的缺点。例如，植物材料水解处理的低产率导致了D-木糖醇的低纯度。因此，水解处理后必须通过离子交换除去用于水解的酸和染料，并且合成的D-木糖必须进一步的结晶以除去其它的半纤维素糖类。为了获得适于作为食品的D-木糖，还要求进一步的纯化。这些离子交换处理和结晶处理导致了生产成本的增加。

因此，人们改进一些生产木糖醇的方法，利用易得到的原料并只产生了很小的浪费。例如，一些改进的方法利用其它的戊糖醇作为初始原料。其中一种易得到的戊糖醇是D-阿拉伯糖醇，并且D-阿拉伯糖醇可由酵母产生(加拿大微生物学杂志，31.，1985，467-471；和普通微生物学杂志，139，1993，1047-54)。

因而，一些利用D-阿拉伯糖醇为原料生产木糖醇的方法得到了发展。在应用微生物学，18，1969，1031-1035，上报道了一种方法，其中D-阿拉伯糖醇是由葡萄糖通过汉逊氏德巴利氏酵母(Debaryomyces hansenii)ATCC 20121菌株发酵获得，然后利用弱氧化醋杆菌(Acetobacter suboxydans)转化为D-木糖，再在季也蒙氏假丝酵母(Candida guilliermondii)var.soya的作用下将D-木糖转化为木糖醇。

EP 403 392A和EP 421 882A公开的方法通过利用耐渗透压的酵母发酵产生D-阿拉伯糖醇，然后利用醋酸杆菌属、葡糖杆菌或克雷白氏杆菌属的杆菌将D-阿拉伯糖醇转化为D-木酮糖，通过葡萄糖(木糖)异构酶的作用由D-木酮糖形成木糖和D-木酮糖的混合物，再通过氢化作用将木糖和D-木酮糖的混合物转化为D-木糖醇。同时，也公开了木糖醇的产生包括木糖和D-木酮糖的混合物中的木糖的预浓缩以及通过氢化作用将浓缩的木糖转化为木糖醇。

尽管上述利用D-阿拉伯糖醇作为原材料产生木糖醇的方法有比较高的产量，然而，存在着一个缺点即要求多个反应步骤，因此生产过程变得复杂。所以，在经济上是不可能被接受的。

另一方面，人们试图通过基因操作技术来繁殖木糖醇发酵微生物。国际公开的WO94/10325公开了使用重组微生物由葡萄糖发酵产生木糖醇的方法，所述重组微生物是通过将来自克雷白氏杆菌属杆菌的阿拉伯糖醇脱氢酶基因和来自毕赤氏酵母(Pichia)属杆菌的木糖醇脱氢酶基因导入阿拉伯糖醇发酵微生物(属于念珠菌属、球拟酵母属或接合糖酵母属的酵母)而获得的。

然而，上面所述的通过基因操作技术来繁殖木糖醇发酵微生物作为一种实用方法是不完善的。

另外，木糖醇脱氢酶是一种催化由木糖生成木糖醇反应的酶，已知其存在于各种微生物中。例如，酵母具柄毕赤氏酵母(Pichia stipiti)(发酵生物工程杂志，67.25(1989))，Pachysolen tannophilus(发酵技术杂志，64.219(1986))，休哈塔假丝酵母(应用生物化学生物技术，26.197(1990))，近平滑假丝酵母(生物技术生物工程，58，440(1998))，汉逊氏德巴利氏酵母(应用生物化学生物技术，56，79(1996))和出芽茁霉(Pullularia pullulans)(An.Acad.Brasil.Cienc.，53，183(1981))，丝状杆菌如黑色曲霉(微生物学，140，1679(1994))和粗糙链孢霉(FEMS Microbiol.lett.，146，79(1997))，藻类如Galdieria sulphuraria(植物，202，487(1997))，细菌如Morgannelamorganii(细菌学杂志，162，845(1985))，等等。