[发明专利]一种新的基因定位方法及试剂盒

说明书

本发明涉及分子遗传学，更具体地涉及一种新的基因定位以及确定生物体在一遗传位点上的基因型的方法。本发明还涉及用于该方法的相关试剂盒。

基因定位是目前分子遗传学研究的重要手段，是图位法分离基因的必须步骤。在用图位法克隆基因的过程中，基因定位技术直接关系到是否能够克隆到基因，及以多快的速度克隆到基因。近年来，基因定位技术迅速发展，不断改进和完善基因定位的方法是分子遗传学研究的必然趋势。

定位基因需要标记物(Marker)来作为参照。目前，常用的标记物主要有两类：1)可见标记物(Visible marker)；2)分子标记物(Molecular Marker)。在分子标记物中经常使用的标记物的类型有：(a)限制性片段长度多态性标记物(Restrictionfragment length polymorphism，简称RFLP[Chang et al，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85，6856-6860])，(b)简单序列长度多态性标记物(Simple sequence lengthpolymorphism,简称SSLP[Bell et al，1994，Genomics 19：137-144])，(c)酶切扩增的多态性片段标记物(Cleaved amplified polymorphic sequences，简称CAPS[Konieczny et al，1993，Plant J 4：403-410])，(d)派生的酶切扩增的多态性片段标记物(derived Cleaved amplified polymorphic sequences，简称dCAPS[Michaels et al，1998，Plant J.14，381-385；Neff et al，1998，Plant J.14，387-392])等。

在基因定位时，是以已知位置的标记物为参照，将待定位基因与不同的标记物相对位置的进行比较，从而决定了各自在染色体上的位置。由此可见，已知位置的标记物数量和密度决定了被定位基因位置的精确度，各种标记物使用时简便与否决定了定位一个未知基因的速度。

然而，目前本领域在基因定位中所使用的各种标记物都存在着各种明显的缺陷。

可见标记物，是最经典的遗传定位使用的标记物，由一批生物突变体所组成。定位时将要定位的突变体与已知位置的突变体杂交，通过对杂交后代的分析，统计发生DNA重组交换的次数，计算出位置。这种方法的优点是成本低，缺点是定位所需的时间长，要做大量的杂交，工作量大。另外，如果发生被定位的基因与作为标记物的基因相互作用，共同调节某一生物学过程，就无法计算重组的数量，也就无法定出基因的位置。

RFLP，是最早使用的分子标记物。使用分子标记物不存在由于基因相互作用而无法定位基因的问题。另外，从理论上推测RFLP标记物的密度比可见标记物高得多。但是，用RFLP法定位基因要做步骤繁琐的分子杂交实验。如果要在图位法克隆基因中筛选重组子(通常这一过程要筛选1000到数千个重组子)，用RFLP方法很难做到。

CAPS是另一种分子标记物。用CAPS进行基因定位的原理同RFLP法相似，操作上不同的是CAPS基因定位法用PCR代替了分子杂交。在PCR完成之后，用不同的限制性内切酶处理PCR产物，根据酶切结果判断待定位基因与已知CAPS标记物的距离。用PCR加上酶切反应替代分子杂交减少了繁琐的操作。但是，由于限制性酶的价格较贵，实验成本较高。

SSLP是一种新的分子标记物。用SSLP基因定位法也是一种通过PCR进行定位的方法，操作较为简单。在PCR后，直接将PCR产物进行凝胶电泳分离便能计算被定位基因与已知标记物的距离。这种方法的缺点是SSLP标记物在基因组(例如植物等)中的数量非常少，无法满足精度较高的基因定位。

dCAPS是一种新的分子标记物。dCAPS基因定位法利用DNA序列中单个核苷酸变化这样的多态性，人为创造限制性酶切位点。简而言之，在设计引物时，在配对于有差异的单核苷酸附近人为地改变1-2个核苷酸，形成一个酶切位点。这样，在用这对PCR引物对有多态性的两个基因组DNA进行PCR反应后，其中一个PCR产物能被相应的限制性内切酶酶切而另一个则不能，根据这种差异就能区分不同的基因型。从目前的研究结果看，这种多态性所形成的标记物是生物体中出现的频率最高的标记物。它的缺点是整个过程仍然较繁琐，而且所用的限制性内切酶价格昂贵，增大了实验成本。

因此，本领域中现有的各种标记物在数量/密度难以达到精确定位的要求，和/或在基因定位时的步骤繁琐、成本高。