[发明专利]葡萄的再生系统及其应用

说明书

                     发明背景

本发明涉及使葡萄植株再生的方法和用这种方法产生的葡萄种质。

葡萄藤是具有古老起源的温带落叶水果作物。葡萄产量(6×10⁶公吨)超过了任何其它温带水果作物的产量，在柑桔类和香蕉产量之后据第三位。另外，由于其在新鲜水果、果汁、果冻、葡萄干和葡萄酒方面的用途，葡萄的价值超过了所有其它水果作物。因此，改良葡萄的成功努力可能对工业化葡萄栽培具有重要影响。

目前改良葡萄藤的方法是耗时费力的。例如，通过传统的育种进行的葡萄遗传改良受诸如结果期前(pre-bearing age)时间长和倍性水平改变的许多因素的严重限制。栽培葡萄也是高度杂合的，一般不能由种子纯育。而且，葡萄育种程序是昂贵的长期计划。尽管植物生物技术是葡萄遗传改良的一个有吸引力的替代方法(Kuksova等，Plant CellTiss.Org.Cult.49：17-27，1997)，但仅当有有效的再生系统时，才能应用体外遗传操作。因此，减少任何这些问题的方法均代表本领域的重大进展。

                     发明概述

我们已经发现了使多年生葡萄胚胎发生培养物生长的方法和采用液体悬浮培养物在相对短时间内由这种多年生胚胎发生培养物生长大量葡萄体细胞胚的方法。本发明的方法提供几个优点。例如这些方法促进非常高频率的体细胞胚的形成和植物再生。先前尚未报道过任何已知的栽培品种的葡萄藤再生具有这种频率，这种频率使得该方法可用于大规模生产葡萄植株的克隆栽植材料。另外，所述方法产生的胚胎无诸如融合和体细胞胚扁化(fasciation)等常见的异常。本发明的方法也导致胚胎发生培养物起始频率提高，使得能够产生高胚胎发生培养物，这种高胚胎发生培养物然后可以成功地通过再生过程的随后阶段至完整植株水平。由于具有这些优点，本发明的方法尤其可用于应用这种作物遗传改良的生物技术。

因此，第一方面，本发明特征性描述了产生成熟体细胞胚的方法。该方法包括以下步骤：(a)提供包括胚胎发生细胞在内的液体培养物；(b)由该培养物回收胚胎发生细胞；(c)将胚胎发生细胞转移至第二培养物；和(d)由所述胚胎发生细胞生长出葡萄成熟体细胞胚。

所述胚胎发生细胞最好得自花药、子房、胚珠、花组织、营养组织、蔓、叶、根、珠心组织、茎、种子、原生质体、中柱鞘、顶端分生组织、胚胎发生组织、体细胞胚或合子胚。在再一优选实施方案中，步骤(a)的液体培养基包括植物生长调节物(例如生长素、NOA(萘氧乙酸)、吲哚-3-乙酸(IAA)、麦草畏、毒莠定(picloram)、萘乙酸(NAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、细胞分裂素、苄基腺嘌呤(BA)、噻二唑素(thidiazuron)、玉米素、脱落酸(ABA)或赤霉酸(GA)。在其它优选的实施方案中。起始培养基包括至少0.01mg/L细胞分裂素；至少0.1mg/L一种糖；和至少0.1mg/L含氮化合物。典型的糖包括蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和甘油。典型的含氮化合物包括硝酸钾、硝酸钙、硝酸铵和硫酸铵。如果需要，可以用DNA(例如编码能够赋予抗病性的基因的DNA)转化所述胚胎发生细胞或体细胞胚。可以通过过滤、沉降或选择，从第一培养物回收所述胚胎发生细胞。另外，可以筛分第一培养物，以使分化的葡萄体细胞胚的形成同步。

步骤(a)的胚胎发生细胞最好得自选自以下的来源：按照第一方面的步骤(a)和(b)产生的胚胎发生细胞；按照第一方面的步骤(a)-(d)产生的葡萄体细胞胚；按照第一方面的方法产生的成熟体细胞胚；按照第五方面的小植株；和来自按照第一方面的方法产生的成熟体细胞胚产生的植物的花药、子房、胚珠、花组织、营养组织、蔓、叶、根、珠心组织、茎、种子、原生质体、中柱鞘、顶端分生组织、胚胎发生组织、体细胞胚或合子胚。

在优选实施方案中，该方法还包括将所述体细胞胚转移至萌发培养基以生长出葡萄小植株。

在其它优选实施方案中，如果需要，在包括植物生长调节物在内的培养基上培养所述胚胎发生细胞。

第二培养物可以是液体培养物或固体培养物。液体培养物的优选培养基包括B-5主要盐和MS次要盐。

第二方面，本发明特征性描述了产生葡萄体细胞胚的方法。该方法包括以下一般步骤：(a)提供包含胚胎发生细胞的液体培养物；(b)从所述培养物中选择所述胚胎发生细胞；(c)将所述胚胎发生细胞转移至第二培养物；和(d)由所述胚胎发生细胞生长出葡萄体细胞胚。