[发明专利]植物核黄素生物合成基因及其用途

说明书

一般地，本发明涉及参与植物核黄素生物合成的酶活性。具体地，本发明涉及编码双功能酶GTP环化水解酶II／DHBP合成酶和核黄素合成酶复合物β亚基(2，4-二氧四氢蝶啶合成酶)的植物基因。本发明有多种应用，包括这些核黄素生物合成酶在异源宿主中的重组生产，具有除草剂活性的化学品的筛选，和由此鉴定的除草剂化学品在控制不需要的植物的生长中的应用。本发明也可用于开发植物、植物组织、植物种子和植物细胞的除草剂耐受性。I．核黄素生物合成

所有的植物和许多微生物均合成核黄素(维生素B2-6，7-二甲基-9-(1-D-核糖醇)-异咯嗪)。因为核黄素是碳水化合物酶促氧化必需的辅酶如FAD和FMN的前体，所以它为基本代谢所必需。核黄素的生物合成始于鸟苷-5'-三磷酸(GTP)并经过若干酶促反应步骤，正如Mironov等在Mol．Gen．Genet．242：201-208(1994)的图1中所概述，该文以参考文献并入本文。

GTP环化水解酶II是核黄素生物合成的第一个酶，催化从GTP合成2，5-二氨基-4-氧-6-核糖氨基-嘧啶-5'-磷酸。DHBP合成酶催化5-磷酸核酮糖转化为3，4-二羟-2-丁酮磷酸(DHBP)。在芽胞杆菌(Bacillus)中，这两个酶活性是由一个双功能酶来完成；而在大肠杆菌中则是由两个单独的酶来完成。

核黄素生物合成酶蛋白是大约1，000，000道尔顿的酶复合物，含有约60个β亚基和3个α亚基。β亚基形成一个衣壳，催化2，4-二氧-5-氨基-6-核醇氨基(ribitylamino)-嘧啶(DARP)和3，4-二羟基-2-丁酮磷酸(DHBP)转化为6，7-二甲基-8-核醇基-2，4-二氧-四氢蝶啶(2，4-二氧四氢蝶啶)；因此，β亚基也称为“2，4-二氧四氢蝶啶合成酶”。然后，包含在β亚基衣壳内的α亚基催化两单位的2，4-二氧四氢蝶啶转化为一个DARP分子和一个核黄素分子，其中DARP分子重循环进入核黄素合成酶的第一个反应。II．除草剂的开发

在田间使用除草剂以控制不需要的植物如杂草的生长已几乎成为一个普遍的做法。除草剂市场每年超过150亿美元。尽管广泛使用除草剂，对于农民而言杂草的控制仍是一个重要而花费很大的问题。

除草剂的有效使用需要合理的操作。例如，应用的时间和方法以及杂草植物的生长阶段对于除草剂获得良好的杂草控制是关键的。由于许多种杂草抗除草剂，所以生产有效的新除草剂变得愈加重要。现在可运用重组DNA技术进行高通量筛选开发新的除草剂。植物生长发育必需的代谢酶可通过标准分子生物学技术重组生产，并可用作除草剂靶标筛选新的酶活性抑制剂。然后可将经此筛选发现的新抑制剂用作除草剂以控制不需要的植物，III．除草剂耐受性植物

不幸的是，具有较强效力、较宽杂草谱系和较快土壤降解能力的除草剂对作物也具有较大的毒性。解决该问题的一个方法是开发能抵抗或耐受除草剂的作物。耐受除草剂的作物杂交品种或变种可允许使用除草剂杀灭杂草，而没有同时伤害作物的危险。由于作物对除草剂敏感，以前除草剂的使用是被排除的或受限制的(例如限于植物出土前使用)，而耐受性的开发可允许除草剂应用于该作物。例如，Anderson等的美国专利4，761，373涉及具有各种咪唑烷酮或磺胺类除草剂抗性的植物。该抗性通过乙酰羟酸合成酶(AHAS)的改变来获得。Goodman的美国专利4，975，374涉及含有突变谷酰胺合成酶(GS)编码基因的植物细胞和植物，它们能抵抗已知抑制GS的除草剂如膦丝菌素和甲硫氨酸磺亚胺(sulfoximine)的抑制作用。Bedbrook等的美国专利5，013，659涉及表达突变乙酰乳酸合成酶的植物，突变的乙酰乳酸合成酶使该植物具有抗磺酰脲除草剂抑制的能力。Somers等的美国专利5，162，602公开了耐受环己二酮和芳氧基苯氧基丙酸除草剂的植物。该耐受性通过改变乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)来获得。定义

为清楚起见，对说明书中采用的某些术语进行了定义并陈述如下：