[发明专利]测定细菌的抗生素敏感性的方法

说明书

本发明总体上涉及测定微生物对抗生素的敏感性的方法和装置，具体涉及测定抗生素对微生物的最小抑制浓度的方法和装置。

抗生素的最小抑制浓度(MIC)的测定是一项测定微生物(通常是细菌)对特定抗生素的敏感性的基本实验。MIC是指防止微生物生长所需的抗生素的最小浓度。通常根据这类实验判断抗生素的类别和剂量，从而得出对患者护理和成本低的治疗都极为重要的迅速且准确的结果。最常应用定性的Kirby-Bauer平板法进行抗生素敏感性测试，但至于定量MIC分析，最常应用“管稀释法”。

Kirby-Bauer实验利用覆盖了一层均匀的、专为手头实验配制的微生物生长培养基的平板。将一些薄片置于这层生长培养基上，每片含特定浓度待评估的抗生素。细菌在培养基上生长形成可见的覆盖层，但在具有抑制细菌生长所需足够抗生素浓度的那些薄片周围的区(常被称为“清亮区”)却例外。围绕薄片的清亮区的大小指示微生物对含于该特定薄片中的抗生素的敏感性；即，清亮区愈大，微生物对含于该薄片中的抗生素的敏感性就愈大。Kirby-Bauer实验因其简单和能同时估测多种抗生素而得以普及。Kirby-Bauer实验的一个缺点在于，有若干变量影响生长培养基中任何给定点处的抗生素浓度，所以，不能计算MIC。已发表了有关基于清亮区大小计算近似的MIC的公式，但这些公式很少被应用并被认为充其量不过是近似法。

“管稀释法”包括：将等量的靶微生物置于很多布置在母板中的孔(被称为“管”)内，再往每个管添加不同浓度的抗生素。靶微生物不能生长的最低抗生素浓度决定了对该具体微生物的MIC。“管稀释法”的一个缺点是，它的精确度取决于管与管之间浓度变化的幅度。小幅度导致更大的精确度，但可能需要实际上达不到的数量的管和工作。此外，配制准确的稀释液是一项费用大的操作，它的成本随着管数量的增多而增大。因此，该方法精确度的提高还能增大成本和延长所需时间。

另一种进行MIC测定的方法被描述于美国专利No．4，778，758和其它文献中，该方法涉及“E-条带(E-Strip)”的应用，“E-条带”是一种结合了准确形成的单一抗生素梯度的条带。沿该条带的一边布置了校准标记物，相应于该点处抗生素的准确浓度。将该条带置于接种过的Kirby-Bauer平板上，保温后，如果该梯度内的一个抗生素浓度超过MIC值，就会形成邻近微生物生长区的清亮区。相应于清亮区和生长区之间的界限的校准标记物给出待评估抗生素的MIC值。关于测定抗生素的MIC的该方法的几个缺点包括但不限于：1)该条带难于制作，所以昂贵；2)该条带的尺寸使得不能在一个装置中同时进行多种抗生素实验；以及3)在准确的保温期后就必须读取所述制剂以实现最佳准确性。

美国专利No．5，702，684公开了一种监测抗生素含量的方法，该方法应用荧光标记物来测定工业管道系统中什么时候应该补充抗生素。但是，该方法不能测定MIC或进行任何类型的抗生素敏感性测定。

需要的是一种测定抗生素对靶微生物的MIC的方法，一种能在最短时间内测定MIC的方法，一种提供准确的MIC的方法，一种能同时测定数种抗生素对靶微生物的MIC值的方法，以及一种成本低的方法。

因此，本发明的一个目的是提供一种测定抗生素对靶微生物的MIC的方法，该方法在最短时间内提供准确的结果。

本发明的另一目的是提供一种测定数种抗生素对靶微生物的MIC的方法。

本发明的又一目的是提供一种测定抗生素对靶微生物的MIC的成本低的方法。

本发明的又一目的是提供一种测定抗生素对靶微生物的MIC的成本低的装置，该装置在最短时间内提供准确的结果。

本发明的又一目的是提供一种实用于兽医的、测定抗生素对靶微生物的MIC的方法。

按本发明，提供了一种测定抗生素对靶微生物的MIC的方法，该方法包括如下步骤：

(a)提供一种微生物生长培养基；

(b)提供一种敏感试剂，它包含与一种标记物混合的抗生素，所述标记物具有大小与该标记物的浓度成比例的信号；

(c)将所述敏感试剂按一定的方式掺到该生长培养基中以至在所述生长培养基中产生抗生素浓度和标记物浓度的梯度；

(d)用靶微生物接种该生长培养基；

(e)将接种过的生长培养基保温达足以使靶微生物生长到可检测量的一段时间；

(f)测定在具有可检测的靶微生物生长的生长培养基部分与基本上没有可检测的靶微生物的部分之间的生长界限；以及

(g)测量生长界限处标记物信号的大小；以及