[发明专利]生产耐受或抗除草剂的植物的方法

说明书

本发明涉及一种生产耐受或抗除草剂的植物的方法，尤其涉及与非转基因的类似植物比较时表现出基本上抗或基本上耐受除草剂的转基因植物的生产。

当给基本上“耐受”除草剂的植物施用除草剂时，它们可产生一种与由类似进行的非耐受性类似植物产生的剂量/反应曲线相比时向右偏移的剂量/反应曲线。这类剂量/反应曲线具有绘制在x轴上的“剂量”和绘制在y轴上的“杀死百分比”、“除草作用”等。耐受性植物需要的除草剂多于非耐受性类似植物以便产生特定的除草作用。当以一般由农用化学品协会使用的浓度和比例给植物施用除草剂以杀死土壤中的杂草时，基本上“抗”除草剂的植物很少(如果有的话)表现出坏死、裂解、萎黄病或其它病变。抗除草剂的植物也耐受除草剂。将术语“抗”和“耐受”在本申请的上下文中解释为“耐受和/或抗”。

特别与本发明相关的除草剂是那些能够在体外抑制4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD或4HPPD)的酶类的物质。这类除草剂已经被公开：诸如在法国专利申请9506800和95 13570中特别描述的异噁唑类，且特别是isoxaflutole(一种选择性的玉米除草剂)；二酮腈类诸如那些在欧洲专利申请0496 630、0496 631中所述的物质、特别是2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO₂CH₃-4-CF₃-苯基)丙烷-1,3-二酮和2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO₂CH₃-4-2,3Cl₂苯基)丙烷-1,3-二酮；在欧洲专利申请0 625 505和0625 508中所述的三酮类、特别是磺草酮、mesotrione(BSI-申请的)、pyrazolynate和苄草唑。能够提供耐受这些除草剂的公知基因是那些编码HPPD酶类的基因。

本发明提供了生产抗或耐受体外抑制4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(4HPPD)的除草剂的植物的方法，该方法包括下列步骤：

(ⅰ)用一种包括编码八氢番茄红素去饱和酶(PDS)的区的多核苷酸来转化植物材料；

(ⅱ)将由此转化的材料再生成形态正常的植物。

由所述多核苷酸包含的区可以具有SEQ ID No.1所描述的序列或可以是与在55℃-60℃的温度下和含有0.1％SDS的强度为0.3的柠檬酸缓冲盐水中培养、随后在相同温度下用含有0.1％SDS的强度为0.3的柠檬酸缓冲盐水冲洗时仍然与SEQ ID No.1所描述的序列杂交的一种序列互补的序列。优选八氢番茄红素去饱和酶来源于细菌，如SEQ ID No.1所述，并来源于噬夏孢欧文氏杆菌和/或特别是不需质体醌9作为辅因子的一种细菌。然而，该去饱和酶可以来源于植物，诸如特别是单子叶植物或双子叶植物、特别是拟南芥属或伞形科植物，例如胡萝卜。它可以是天然的或可能是突变的，同时基本上保持对HPPD抑制剂诸如异噁唑类除草剂诸如Balance^TM除草剂或三酮类的耐除草剂的特性。由上述方法生产的除草剂抗性植物可以通过其对体外抑制4HPPD的除草剂的抗性来选择。然而，可以进一步优选的情况是编码八氢番茄红素去饱和酶的多核苷酸进一步包括有利于选择再生转化体(transformats)的选择标记基因。合适的选择标记基因包括诸如卡那霉素、潮霉素和庆大霉素这样的抗生素抗性基因；诸如含草甘膦除草剂这样的另外的除草剂抗性基因；诸如eutypine这样的毒素抗性基因。其它的选择形式也是可使用的，诸如以激素为基础的选择系统诸如Hiroyrasu Ebinuma等在1997 PNAS第94卷2117-2121页中所述的Multi Auto Transformantion(MAT)系统；使用公知绿色荧光蛋白质、β-葡糖醛酸糖苷酶(glucoronidase)、甘露糖异构酶、木糖异构酶和2-DOG的目视选择系统。

可以(或已经可以)进一步用下列多核苷酸对所述的植物材料进行转化：包括编码能够产生具有抗或耐受除草剂、昆虫、脱水和/或真菌、细菌或病毒感染的蛋白质的区的多核苷酸；能够编码可产生改进质量的性状诸如提高的产量、改变的淀粉质量和/或提高的营养含量的蛋白质的多核苷酸。