[发明专利]谷氨酰胺酶活性增强的微生物培养物及其应用

说明书

                      技术领域

本发明涉及谷氨酰胺酶活性增强的微生物培养物的调制方法。具体地，本发明涉及消除能产生谷氨酰胺酶的微生物在培养过程中的产物抑制作用，并在培养中期根据需要补给氮源来调制谷氨酰胺酶活性增强的微生物培养物的方法。

另外，本发明涉及谷氨酰胺酶活性增强的微生物培养物、应用该微生物培养物的蛋白水解物的制备方法以及按该制备方法制得的蛋白水解物。此蛋白水解物谷氨酸含量高，所以呈味力强，作调味料的应用价值高。

                      背景技术

谷氨酰胺酶是广泛分布于生物界的酶，是作用于L-谷氨酰胺，将酰胺基水解，生成L-谷氨酸和氨的酶。

L-谷氨酸用氢氧化钠或碳酸钠中和得到的L-谷氨酸钠是所有鲜味的基本物质。此物的最大用途是作调味料，不仅家庭用，也是加工食品制造中不可缺少的添加物。

另外，至今已知的天然调味料主要是将蛋白质分解进行制造为主。天然调味料中，分解型天然调味料有酸分解型和酶分解型。酸分解型调味料中有以大豆、小麦等植物性蛋白质为原料制成的水解植物蛋白和以动物胶、乳酪蛋白等动物性蛋白质为原料制成的水解动物蛋白。其主成分的氨基酸组成，因原料不同而有很大差异，从而影响呈味、甜味等。例如：脱脂大豆用盐酸分解法制得的分解液，分解率(甲醛态氮(用甲醛滴定法测得)/总氮)70％以上，谷氨酸游离率(谷氨酸/总氮)高达1.2，在鲜味上是很出色的。

但是，一般用盐酸分解法生产蛋白水解物时，需要100℃、1-2天的条件，这种高温长时反应，能源消耗很大。而且蛋白质的酸法水解虽然简便，但也有发生异臭、氨基酸分解过度，中和后盐分高等缺点。

此外近年酸水解法被指出会生成对人体有害的一氯丙醇、二氯丙醇等氯代醇，作为食品素材仍成为问题。

另一方面，用酶来制备氨基酸的方法，自古以来做了很多尝试。为了把复杂的底物分解成氨基酸，复合酶是必要的。通常为了达到这一目的，利用以米曲霉(Aspergillus oryzae)为主的曲霉。由此法制得的氨基酸液的代表是酱油。酱油是将蛋白质原料经加热处理、接种曲霉后在食盐水中发酵、熟成而制成的。

但是，这种方法且不说需要很多劳力和时间，还有氨基酸游离率低，特别是大豆蛋白质中含量最多，而且有对呈味性最重要的谷氨酸游离率低这样的缺点。

这种经蛋白质经酶水解制造的调味料，近年来以欧洲为中心其需求量在增加，但还没有既不含一氯羟丙醇类及二氯丙醇类，又能与盐酸分解相匹敌的鲜味很强的调味料。

在酱油制造中谷氨酸不足的一个主要原因是曲霉的谷氨酰胺酶活性不足。因此，进行了在固体培养中高蛋白酶活性菌株和高谷氨酰胺酶活性菌株通过细胞融合，选育高活性菌株的工作(S.Ushijima，T.Nakadai：Agric.Biol.Chem51，(4)，1051(1987)；S.Ushijima，T.Nakadai，K.Uchida：Agric.Biol.Chem51，(10)，2781(1987)；S.Ushijima，T.Nakadai，K.Uchida：酱研，17，(3)，89(1991)，特公平3-73271号公报、特公平3-68672号公报)。

另外，很多酶系，都已知因碳源的消耗速度快，使其酶的生物合成受到阻碍，发生产物抑制(Aunstrp，K.et al：“MicrobiolTechnology”Vol.1(2^ndedition)，AcademicPress，NewYork，282(1979))。利用构巢曲霉(Aspergillus nidulans)进行其脯氨酸代谢系酶的研究、乙醇利用系酶的研究，利用米曲霉研究高麦芽糖酶基因表达调控的工作不断深入。creA的基因产物为creA蛋白，对各种酶的合成进行负调控(塚越规弘：化学和生物，32(1)，48(1994))。

但是对构巢曲霉来说，只有报告说当培养时的氮源为铵时，谷氨酰胺酶的生产才受到抑制，而没有曲霉、酵母的谷氨酰胺酶受到产物抑制的报告。而且，关于各菌株的液体培养中的谷氨酰胺酶也只有以下的报告。