[发明专利]由正常人皮肤组织衍生的无限增殖细胞系

权利要求书

1．一种由至少一种逆病毒来源的功能性肿瘤基因无限增殖化的人角质细胞系，具有如下特点：

(ⅰ)非致瘤性的；

(ⅱ)即使在多次传代后仍保有分化能力和表达正常分化的角质

  细胞表达的酶和蛋白质的能力；以及

(ⅲ)当在无血清培养基中且无滋养层细胞进行器官型培养

  时，形成具角质层正常角质细胞的复层极化上皮。

2．权利要求1的人角质细胞系，由至少两种不同的逆病毒的逆病毒来源的功能性肿瘤基因无限增殖化。

3．权利要求2的人角质细胞细胞系，其特征在于该功能性肿瘤基因衍生自SV40病毒和人乳头状瘤病毒16。

4．权利要求3的人角质细胞细胞系，其特征在于每种功能性肿瘤基因包括在独立的逆病毒结构中。

5．权利要求4的人角质细胞细胞系，其特征在于该细胞系是具有根据布达佩斯条约保藏的保藏号CNCMI-1996的细胞系DK7-NR。

6．一种改进的无限增殖化人皮肤细胞从而获得无限增殖的角质细胞的方法，包括下列步骤：

(ⅰ)分离人皮肤样本；

(ⅱ)制备体外培养的皮肤样品；

(ⅲ)从人皮肤制备的样品获得角质细胞，将该角质细胞接种

  于无血清的生长培养基中，培养板被促进细胞固定和生长的

  纤连蛋白，Ⅰ型胶原蛋白和SAB包被；

(ⅳ)以足以获得培养中细胞最佳汇合生长的方式替换培养基；

(ⅴ)将角质细胞转移到预先以相同方式包被的培养板上的无血清

    选择培养基中；

(ⅵ)用至少两种不同逆病毒的功能性肿瘤基因感染角质细胞；

(ⅶ)转移所得的无限增殖的角质细胞到以相同方式包被的培

   养板上的适合无限增殖的角质细胞增殖的培养基中；

(ⅷ)转移所得的增殖的角质细胞到以相同方式包被的培养瓶

   中具高含量钙的分化培养基中。

7．权利要求6的方法，其特征在于功能性肿瘤基因衍生自SV40病毒和人乳头状瘤病毒16。

8．权利要求7的方法，其特征在于每个功能性肿瘤基因包括在独立的逆病毒结构中。

9．权利要求8的方法，其特征在于所用逆病毒结构为载体pLXSHD+SV40(#328)和pLXSHD+E6/E7。

10．权利要求6的方法，其特征在于在步骤(ⅲ)，(ⅴ)或(ⅶ)中无血清培养基为NR-3培养基。

11．权利要求6的方法，其特征在于步骤(ⅷ)中的分化培养基为具有至少1.5mM含量钙的改良的NR-2培养基。

12．权利要求1的角质细胞在皮肤反应的免疫学、药理学、光和化学毒理学分析及异源基因表达方面的应用。

13．权利要求12的应用，其特征在于使用了细胞系DK7-NR，它具有根据布达佩斯条约保藏的保藏号CNCMI-1996。

14．人造皮肤，其特征在于包括权利要求1的角质细胞细胞系。

15．权利要求14的人造皮肤，其特征在于包括具有根据布达佩斯条约进行保藏的CNCMI-1996细胞系DK7-NR。