[发明专利]由正常人皮肤组织衍生的无限增殖细胞系

说明书

本发明涉及由正常人皮肤组织衍生的新的无限增殖的细胞系，该细胞系具有改善的分化特性，涉及制备这些细胞系的新方法及其应用，尤其在创造人工皮肤的领域。技术状况

从正常人皮肤组织衍生的无限增殖细胞系的制备已有过描述。一般地，为此目的方法包括人皮肤细胞的转化，例如角质细胞和黑色素细胞，在体外培养加入传送无限增殖化的试剂。无限增殖化涉及细胞的生产，细胞可在体外长期培养，理论上为无限时期。这些细胞也命名为传代细胞系(连续细胞系)。与之对照，非无限增殖的细胞体外仅能在有限次数细胞分裂过程中增殖。无限增殖化细胞非常有益，因其提供具有一定特性的稳定的，假定无限的细胞来源，无限增殖化细胞系和无限增殖化人皮肤细胞系的制备用的典型药剂特别包括，例如病毒、重组病毒和包含传送无限增殖化特性的DNA序列的质粒。

无限增殖的人细胞系制备的最普通方法包括猿猴病毒40(SV40)的序列和更具体的SV40的大T抗原(T-Ag)的DNA作为无限增殖化试剂的应用。例如，Steinberg等，细胞生理学，123,117-125(1985);US4885238(Reddel等);US4707448(Major);stoner等.，癌症研究.,51,365-371(1991);Chopra等.,体外细胞发育生物学.,30A,539-546(1994);Chopra等.,体外细胞发育生物学，27A,763-765(1991);Christian等.,癌症研究47,6066-6073(1987);Rhim等.,科学，227,1250-1252(1985);和Grubman等.，胃肠，肝脏生理病理学，29,G1060-G1070(1994)报道了SV40载体及含SV40大T抗原的序列的载体在制备无限增殖的人细胞系中的应用。这些序列的引入一般通过SV40病毒或12/SV40杂交腺病毒感染或包括劳斯肉瘤病毒的长末端重复和调节SV40起始区的重组质粒经磷酸锶存在下的共沉淀进行细胞转化而实现。(见Brash等.，分子细胞生物学，7,2031-2034,1987)

另一个已知的无限增殖化细胞系，特别是无限增殖的人角质细胞的制备方法包括以人乳头瘤病毒(HPV)的DNA序列对细胞的转化或感染。例如，US5376542(Schlegel)描述了采用HPV-16,18,31,33或35分离的E6和E7基因或仅E7基因对人上皮细胞无限增殖化，制备非致瘤的无限增殖的人细胞系。此外，Barbosa等，癌基因，4,1529-1532(1989)；和Münger等，病毒学杂志，63(10):4417-4421(1989)报道了HPV-16和HPV-18的E6和E7基因制备无限增殖的人角质细胞的应用。此外，Dürst等.，癌基因，1,251,256(1987)描述使用乳头状瘤病毒型16进行的角质细胞的无限增殖化。

尽管如此，众多的小组描述了无限增殖的角质细胞系及它们在体外试验中的应用，本领域确定的无限增殖的角质细胞系通常呈现它们利用不便之外的一或更多特性。例如，以往描述的无限增殖的角质细胞呈现以下特性的一或更多种：(ⅰ)分化标志物的表达的减少或丢失，例如由正常分化角质细胞表达的蛋白，(ⅱ)组织培养中生长特性的改变和(ⅲ)形成具有角化不全角质层的复层极化上皮。

为消除这些缺陷，EP 780496(Société des Produits Nestlé)提出无限增殖化角质细胞或人黑色素细胞的新方法，使用en sus新培养基，从SV40病毒衍生的载体PLXSHD+SV40(#328)，或从人乳头状瘤病毒16(HPV-16)衍生的同等载体PLXSHD+E6/E7。由此方式获得的无限增殖的细胞保留分化的能力以及表达正常分化的角质细胞和黑色素细胞表达的蛋白和酶的能力，即便在培养中多次传代之后。

但是，除以上描述之外，在应用领域还需要具更多改良特性的无限增殖的角度细胞。这样的细胞对许多应用非常有益，尤其是对需要高度分化皮肤细胞的分析。

发明概述

本发明涉及人无限增殖化角质细胞系，该细胞系通过至少一种逆病毒来源的致瘤性功能基因而无限增殖化，具有如下特点：

(1)非致瘤性

(2)组织培养中多次传代后仍保持分化和表达正常分化角质细

   胞表达的蛋白和酶的能力，和

(3)在无血清培养基中且无饲养细胞层中进行器官型培养时，

   形成具有角质层正常角质细胞的复层极化上皮。

本发明的另一目的在于提供制备来源于正常皮肤组织无限增殖化的角质细胞系的新方法。