[发明专利]重组α－L－艾杜糖苷酸酶,其生产和纯化的方法以及治疗其缺乏导致的疾病的方法

说明书

发明领域

本发明涉及分子生物学、酶学、生物化学和临床医学领域。具体的，本发明提供了一种重组α-L-艾杜糖苷酸酶(α-L-iduronidase)、生产和纯化该酶的方法以及治疗包含α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏和粘多糖代谢病I(MPS I)的一些遗传病的方法。

发明背景

糖类在活有机体的活动中起了许多重要作用。除了它们的新陈代谢作用，糖类是人体内与其它许多成分，如蛋白质和脂(称为糖缀合物)共价结合的结构组分。例如，人结缔组织和细胞膜包含蛋白质、糖类和蛋白聚糖基质。该蛋白聚糖基质的糖部分，对机体结构提供了重要的性质。

切开糖的溶酶体酶α-L-艾杜糖苷酸酶的遗传缺陷导致称为粘多糖代谢病I(MPS I)的溶酶体积储异常(Neufeld,E.F.,和Muenzer,J.(1989).“遗传病代谢基础”中的粘多糖代谢病(Scriver,C.R.,Beaudet,A.L.,Sly,W.S.和Valle,D.,编辑)，pp.1565-1587,McGraw-Hill,New York)。MPS I的严重形式常称为Hurler综合征，而且和多种问题，如精神发育迟缓、角膜模糊、粗糙面部特征、心脏病、呼吸系统病、肝和脾肿大、疝和关节强直等相关。患Hurler综合征的病人常在10岁前就死亡。中度形式称为Hurler-Scheie综合征，常不严重影响精神功能，但疾病可导致在10多岁和20多岁的死亡。Scheie综合征是MPS I的最轻形式。它可以具有正常寿命，但关节强直、角膜模糊和心脏瓣膜病导致严重问题。

根据British Columbia调查，估计MPS I的发病率是全部新生儿中1：100，000(Lowry等，人类遗传学85：389-390(1990))，根据爱尔兰的研究，为1：70,000(Nelson，人类遗传学101：355-358(1990))。看来对该疾病没有人种差异。似乎全世界该疾病都被过低诊断，不是因为病人在诊断作出之前就由于并发症死亡，就是因为该综合征的较轻形式可被误诊为关节炎完全忽略。有效的MPS I新生儿普查可以发现一些以前未发现的病人。

除了骨髓移植，没有对MPS I的有意义治疗。骨髓移植在治疗一些该疾病的症状中可能有效，但对MPS I具有高度致病率和死亡率，而且由于缺少合适的捐赠者，通常是不可行的。对所有病人可行的另一种治疗将对治疗和处理该疾病提供重要突破。

发现α-L-艾杜糖苷酸酶能纠正培养Hurler细胞的酶缺乏之后，已长期考虑将酶替换治疗作为MPS I的可能治疗手段。在该纠正过程中，通过受体介导的胞吞作用，将含有甘露糖-6-磷酸残基的酶吸收入细胞，并传递到溶酶体，在其中酶清除贮存的底物、硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素。由于组织中α-L-艾杜糖苷酸酶的来源不足，该治疗对人的应用以前并不可行。酶置换概念首次有效的以修饰的胎盘葡糖脑苷脂酶用于Gaucher病人。Gaucher病人中葡糖脑苷脂酶的传递和有效摄入证明了酶能以足量吸收入体内，来提供有效治疗。

对于MPS I的α-L-艾杜糖苷酸酶治疗，需要一种酶的重组来源来获得治疗上充分数量的酶供应。该哺乳动物酶在1990年被克隆(Stoltzfus等，生物化学杂志267：6570-6575(1992))，而该人酶在1991年被克隆(Moskowitz等，FASEB J6：A77(1992))。

附图简述

图1代表了编码α-L-艾杜糖苷酸酶的cDNA的核苷酸和推断的氨基酸序列。提供了核苷酸1到6200。提供了从开放阅读框中的第一个甲硫氨酸开始的氨基酸。

图2代表根据实施例1中列出的程序获得的洗脱液SDS-PAGE的结果。泳道1是空白。泳道2含有高分子量标准品。泳道3是空白。泳道4含有浓度为50微克的牛血清白蛋白。泳道5到10代表分别含有1微克、2微克、5微克、5微克、5微克和5微克量重组产生的人α-L-艾杜糖苷酸酶的洗脱液。

图3揭示了16个MPS I病人中相对于正常排泄值的尿GAG水平。在未治疗的MPS I病人中，尿GAG水平范围很广。用重组α-L-艾杜糖苷酸酶治疗后，未降解GAG排泄减少了50％以上是衡量人体对治疗有反应的有效手段。

图4显示了MPS I病人酶治疗前后的白细胞艾杜糖苷酸酶活性。

图5显示了酶治疗前后口腔艾杜糖苷酸酶活性。

图6显示了仅用重组酶治疗8周后，三个病人中肝脏和脾脏的充分缩小以及关节和软组织积储的显著临床改善与未降解GAG减少65％以上有关。

图7显示了仅治疗12周后，在用重组酶治疗的病人中，肝脏和脾脏基本正常化。