[发明专利]分枝杆菌的突变株及其在潜在抗生素载体筛选中的应用

说明书

本发明涉及到分枝杆菌的新突变株及其在潜在抗生素载体筛选中的应用。

分枝杆菌感染导致的问题在不断地增加。一些对化疗药物具广谱抗性的菌株的出现更使这一问题加剧。因而，寻找新的活性物质和作用机制势在必行。

分枝杆菌的细胞壁对化疗药物的透过率较低是限制药物抗分枝杆菌效用的一个重要因素(Suzuki,A.E.,Inamine,J.M.:Res.Microbiol.145,1994,210-213；Jarlier,V.,Nikaido,H.:FEMSMicrobiol.Lett.123,1994,11-28)。

克服这一障碍的一个概念性的方法是将抗生素同可被病原微生物主动吸收的载体相耦联。

铁螯合试剂(铁载体)可被用于作这样的载体。在感染部位缺乏铁离子的情况下，许多病原微生物可形成铁载体并将其分泌至外环境。Fe³⁺-铁载体可通过特异的受体同细胞表面相结合，然后被依赖于ATP的渗透酶转运进胞内。已知革兰氏阴性菌不仅可以吸收其自身产生的铁载体，还可吸收其他种类有机体形成的铁载体(外源铁载体)。

对于分枝杆菌的摄铁系统目前所知较少(综述：Wheeler,P.R.,Ratledge,C.:in Bloom,B.R.ed.:Tuberculosis,ASM Press,Washington,DC,1994)。迄今为止确认了两种类型的铁载体，即结合与膜上的亲脂的分枝菌素(Snow,G.A.:Bacteriological Reviews34,1970,99-125)以及胞外的疏脂的铁外螯合素(Macham,L.P.etal.:J.Gen.Microbiol.101,1977,41-49；Hall,R.,Ratledge,C.:J.Gen.Microbiol.133,1987,193-199)。耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)(Sharman et al.:Biochem.J.305,1995,187-196),新金色分枝杆菌(M.neoaurum)(Sharman et al.:Chemistry & Biology 2,1995,553-561)和结核分枝杆菌(M.tuberculosis)(Gobin et al.:Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92,1995,5189-5193)所形成铁外螯合素的结构已被确认。许多种分枝菌素的结构亦已阐明(Snow,G.A.:Bacteriol.Rev.34,1970,99-125)。

从耻垢分枝杆菌，确定了第一个参与铁外螯合素的生物合成和可能涉及Fe³⁺-铁外螯合素的吸收的基因(Fiss,E.H.et al.:Molecular Microbiology 14,1994,557-569)。有四个开放读码框架中的三个(fxuA,fxuB,fxuC)所推测出的蛋白与大肠杆菌的一些膜蛋白具同源性，这些大肠杆菌中的膜蛋白参与肠肝菌素的吸收。因此，这些开放读码框架编码的蛋白估计为Fe³⁺-铁外螯合素渗透酶的亚基，但迄今为止仍无证据。第四个开放读码框架(fxbA)编码一个参与铁外螯合素的生物合成的蛋白。这已被一个生物合成突变体的互补实验所证实。

通过铁外螯合素/分枝菌素的铁转运过程的细节仍属未知。分枝杆菌对外源铁载体的吸收也同样所知较少。迄今为止仅仅表明耻垢分枝杆菌可以利用不同的外源铁载体(Matzanke,B.F.et al.:BioMetals 10,1997,193-203)。是否这些外源铁载体通过特异的摄取系统被吸收，是否它们因此是潜在的的抗生素载体，这些问题只能通过昂贵的Mssbauer光谱法来阐明(Matzanke,B.F.:HyperfineInteractions 112,1998,123-128)。由于这一方法需大量的底物和非常昂贵的设备因此而不适于检测。它只限于少数几个高度专业的实验室，且用于处理的样品只有很有限的产出。

本发明的主要目的在于提供一种非放射性的经济有效的方法用于检测对天然或外源的铁载体以及化学类似物的吸收，这些物质可能成为潜在的抗生素载体。

根据本发明，这一目的已经达到。这是由于一套分枝杆菌的突变体已被生产出，各突变体分别被去除了铁外螯合素/分枝菌素转运体系的不同组分。这套突变体构成了一个快速、经济的检测程序的基础。