[发明专利]拟南芥HMP－P激酶和TMP－PP酶及其在除草剂筛选中的用途

说明书

本发明涉及筛选抑制如下酶活性的除草化合物的方法，所述酶为2-甲基-4-氨基-5-羟甲基嘧啶单磷酸激酶(HMP-P激酶)或硫胺素单磷酸焦磷酸化酶(2-甲基-4-氨基-5-(羟甲基)嘧啶二磷酸：4-甲基-5-(2-磷酸乙基)噻唑2-甲基-4-氨基嘧啶-5-次甲基转移酶)或TMP-PP酶，这两种酶在从头硫胺素生物合成中均有酶促活性。本发明涉及由此鉴定的除草化合物控制不期望的植被(vegetation)生长的用途。本发明还可应用于除草剂抗性植物、植物组织、植物种子及植物细胞的开发。

除草剂用来控制不期望的植被(如作物田间的杂草)的用途已经十分普遍。每年除草剂销售超过150亿美元。尽管应用这样广泛，杂草控制对农民而言仍旧为重要的和费钱的问题。

有效利用除草剂需要大量的管理工作。例如，应用的时间和方法以及杂草植物生长的阶段对于用除草剂取得良好的效果至关重要。由于多种杂草种类对除草剂有抗性，制备有效除草剂变得日益重要。现在可利用采取重组DNA技术的高通量筛选方法发现新除草剂。可重组生产对植物生长和发育十分重要的代谢酶类，并用做筛选新型酶活性抑制剂的除草剂靶标。通过这样的筛选发现的新抑制剂可被用作控制不期望的植被生长的除草剂。

遗憾地是，在土壤中显示较高效力、较宽的杂草谱剂且降解更快的除草剂也具有更大的作物植物毒性。一种解决此问题的方法是培育抗或耐受除草剂的作物。耐受除草剂的作物杂交品种或变种可允许使用除草剂杀死杂草而无损害作物的风险。耐受的形成使得可向作物应用除草剂，而此前由于作物对除草剂的敏感，该除草剂不能应用或限制使用(例如在紧急情况前才应用)。例如，美国专利4761373(Aderson等)涉及对多种咪唑啉酮或氨磺酰除草剂有抗性的植物。所述抗性通过改变的乙酰羟酸合酶(AHAS)赋予。美国专利4975374(Goodman等)涉及含有编码突变谷氨酰胺合成酶(GS)基因的植物细胞和植物，其可抵抗已知抑制GS的除草剂，如phosphinothricin和甲硫氨酸sulfoximine。美国专利5013659(Bedbrook等)涉及表达突变乙酰乳酸合酶的植物，该酶赋予植物抵抗磺酰尿除草剂类的抑制。美国专利5162602(Somers等)公开了耐受环己二酮除草剂类及芳氧基苯氧基丙酸除草剂类的植物。通过改变的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)赋予耐受性。定义为明确起见，用于本说明书的一些术语定义如下：

可活化DNA序列：在基因组尤其是植物基因组中调节基因表达的DNA序列。可活化DNA序列与基因组内源的靶基因互补。当可活化DNA序列导入并在细胞中表达时，其抑制靶基因的表达。可与本发明联合使用的可活化DNA分子包括那些编码或起显性抑制剂作用的分子，如可翻译或非翻译有义序列，其能在稳定转化的植物中破坏基因功能，以阳性鉴定一种或多种植物正常生长和发育必需的基因。一种优选的可活化DNA序列是反义DNA序列。靶基因优选地编码一种蛋白质，如生物合成酶、受体、信号转导蛋白质、结构基因产物或植物生长或生存必需的转运蛋白质。在一个优选实施方案中，靶基因编码具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶。反义序列与靶基因的相互作用的结果导致靶基因表达基本上被抑制，从而杀死植物，或至少抑制正常植物生长或发育。

可活化DNA构建体：一种重组DNA构建体，包含一种与可活化DNA序列有效连接地合成启动子，当其导入细胞(期望地，植物细胞)中时不表达，即：为沉默的，除非存在一种能结合并活化该合成启动子的完整杂合转录因子。将可活化的DNA构建体导入细胞、组织或植物以形成能表达可活化DNA序列的稳定转基因品系。

辅因子：酶催化反应中所需要的天然反应物，如有机分子或金属离子。辅因子是例如NAD(P)、核黄素(包括FAD和FMN)、叶酸、钼蛋白(molybdopterin)、硫胺素、生物素、硫辛酸、泛酸和辅酶A、S-腺苷甲硫氨酸、磷酸吡哆醛、泛醌、甲基萘醌。任选地辅因子可再生和重利用。

偶联合成：一种酶促生物合成，其中终产物通过两个或多个顺序酶促步骤合成，其中在生物化学途径的一个或多个分支中用于第一个酶促步骤的底物补加入反应混合物中，通过第一个酶转化为中间产物，该中间产物被第二个酶或多个酶转化成终产物而无需添加中间产物。

“嵌合”用于表示一种诸如载体或基因的DNA序列，其由通过重组DNA技术相互融合的不同来源的一个以上DNA序列构成，得到一种非天然存在的、尤其是不存在于待转化的植物中的DNA序列。