[发明专利]在转化的酵母细胞中生产蛋白质的方法

说明书

发明领域

本发明涉及蛋白质在转化的酵母细胞中的表达、DNA构建体和用于该过程的载体以及用该载体转化的酵母细胞。

发明背景

众所周知使用转化的酵母菌株来表达蛋白质，参见例如欧洲专利申请0088632A、0116201A、0123294A、0123544A、0163529A、0123289A、0100561A、0189998A和0195986A、PCT专利申请WO95/01421、95/02059和WO90/10075和美国专利4,546,082。

上述方法的共有特性在于酵母生产质粒含有用于抗生素标记的基因。这样的标记基因是由大肠杆菌中的起始克隆步骤产生的，其中将它用于筛选转化的细胞或维持用作载体的质粒。据认为所述的抗生素标记基因对转化的酵母细胞的培养没有任何不良影响，因此通常的做法是不采取任何步骤来缺失这样的DNA。此外，通常通过从所述转化的酵母细胞中分离质粒并将分离的质粒转化入大肠杆菌、随后进行抗生素选择来进行质粒构建体的表征。因此，它适合于保持抗生素抗性标记基因的实际目的。

尽管研究实验室和工业化生产工厂都受到极为严格的安全性管理制度的控制，但是仍然存在小的危害，即少量细胞将偶然被释放到环境中。由于它们极为复杂的特性，这类基因工程微生物仅能存活极短的期限并且对环境的危害程度极低。这当然就是为什么已经批准这类转化的微生物可用于研究和大规模操作的原因。

尽管细胞快速死亡，但是含有抗生素抗性基因的质粒仍然可能偶然被处理到环境中，且如果质粒自然被吸收，那么在理论上存在细菌中引入了抗生素耐受性的危害。

抗生素对于治疗人和动物细菌感染来说是极为重要的。如果可能，应将使用使抗生素产生耐受性的基因导致的任何潜在环境污染的危害降到最低限度。

因此，对开发甚至比迄今为止所用方法更为安全的方法存在一种需求且本发明的目的就是提供这类改进的方法。

发明概述

本发明涉及一种用于在酵母中表达异源蛋白质或多肽的方法，其中用于生产的酵母转化体菌株含有一种表达载体，在该表达载体中已经通过在转化酵母宿主前的体外修饰而使用于起始克隆步骤的抗生素标记基因成为非功能性的。本发明还涉及用于这类方法的DNA序列和表达载体并涉及转化的酵母细胞。

本发明的一个方面涉及一种重组酵母表达载体，它不能够使细菌细胞产生抗生素抗性并且包括编码异源蛋白质的基因和已经通过体外修饰而成为非功能性的抗生素抗性标记基因。

本发明的另一方面涉及一种用于生产所需多肽或蛋白质的方法，所述的方法包括培养一种酵母菌株和从培养基中分离所需产物的步骤，其中所述的酵母菌株含有不能够使细菌细胞产生抗生素抗性并且包括编码异源蛋白质的基因和抗生素抗性标记基因，该标记基因已经在转化酵母宿主前通过体外修饰而成为非功能性的。

本发明的方法一般包括培养一种酵母菌株的步骤，所述的酵母菌株含有一种酵母表达质粒，在该质粒中，用于细菌中起始克隆步骤的功能性抗生素标记基因已经在插入用于表达和分泌所需多肽或蛋白质的酵母宿主前通过体外缺失部分标记基因或整个标记基因而成为非功能性的。

抗生素标记基因的缺失优选通过在抗生素抗性标记基因的每一侧上插入合适的限制切割位点来进行，由此通过用合适的限制酶的体外处理而使所述的标记基因缺失。

本发明还涉及转化的酵母菌株，它含有不能够使细菌细胞产生抗生素抗性的载体并含有编码异源蛋白质的基因和已经在转化酵母宿主前通过体外修饰而使抗生素抗性标记基因成为非功能性的。

酵母菌株优选是酵母属的菌株，且特别是优选酿酒酵母菌株。

本文所用的措词“抗生素标记基因”或“抗生素抗性标记基因”指的是允许对转化的细菌细胞进行表型选择和质粒扩增的基因。

在大肠杆菌中最常用的抗生素抗性标记基因是使氨苄西林(AMP)、氯霉素、新霉素、卡那霉素和四环素产生耐受性的标记基因。

本文所用的措词“非功能性标记基因”指的是标记基因已经缺失或通过缺失部分基因而成为非功能性的。优选所述的基因是完全缺失的。

本文所用的“体外修饰”指的是在细胞环境外的载体上进行的修饰步骤。

本文所用的“不能够使细菌细胞产生抗生素抗性”指的是抗生素抗性基因由于所述的基因操作而在任何生物体中是非功能性的。

本文所用的“酵母宿主”指的是欲用表达质粒或载体转化或转染的酵母生物体。

附图的简要说明

参照附图进一步说明本发明，其中