[发明专利]标记核糖核酸的方法和由此获得的标记RNA片段

说明书

本发明涉及标记合成或天然核糖核酸(RNA)的新方法。

合成RNA是指通过人们开发的技术例如扩增技术(PCR后转录)或转录扩增技术(TMA)获得的RNA。天然RNA是指通过从细胞提取获得的RNA，例如信使RNA、核糖体RNA或转运RNA。

现有技术显示，标记核苷酸、寡核苷酸或核酸有许多方法；寡核苷酸和核酸将用术语多核苷酸表示。寡核苷酸可在合成中标记或通过掺入至少一个标记的核苷酸来标记。

第一种方法包括将标记附加在碱基上，后者可以是天然碱基也可是修饰碱基。第二种方法是将标记附加在糖上，同样后者可以是天然糖也可是修饰糖。第三种方法涉及将标记附加在磷酸上。

标记碱基特别用于通过直接掺入标记的核苷酸来标记核酸的方法。

标记糖常常用于通过化学合成制备核酸探针的情况。

标记磷酸则用于在化学合成多核苷酸时导入功能化的臂或标记。

实际上，标记核苷酸或核苷酸类似物或核酸的技术人员倾向于将标记附加在碱基或糖上，这给他提供更多的方便和更大的选择。而且，大量文献研究也显示这种情况，例如标记碱基的文献EP-A-0,329,198、EP-A-0,302,175、EP-A-0,097,373、EP-A-0,063,879、US-A-5,449,767、US-A-5,328,824、WO-A-93/16094、DE-A-3,910,151和EP-A-0,567,841，或标记糖的文献EP-A-0,286,898。

然而，这些技术有许多缺点，两个主要缺点是标记的存在造成的空间障碍和影响。

当标记碱基时，空间障碍是由于标记侵占了相邻碱基的空间，不管该相邻碱基是由相同链还是互补链的临近核苷酸所携带。同样非常明显，碱基上标记的存在可削弱酶促掺入过程中的效率和特异性，并可影响两条互补链间氢键的质量，从而对杂交不利。

当标记糖时，空间障碍是由于标记侵占了相同链携带的相邻糖基的空间。该标记的存在可疏远相同链携带的两个相邻碱基，从而妨碍了与互补链的有效杂交，因为链间氢键不是最佳的。

将标记附加在磷酸上的技术比功能化碱基和糖所涉及的技术更为复杂。

即使如此，仍有一些文献提出了标记磷酸的技术。例如文献EP-A-0,280,058，其描述了通过将标记附加在磷酸上来标记核苷酸的方法，其中当核苷酸是脱氧核糖核苷酸时，磷酸在2’和/或5’位与糖相连，当核苷酸是核糖核苷酸时，磷酸在2’、3’和/或5’位与糖相连。该文献还描述了包含至少一个上述标记核苷酸的多核苷酸或寡核苷酸；该核苷酸在合成过程中掺入多核苷酸或寡核苷酸中。

然而，文献EP-A-0,280,058提出的标记方法不能使核酸均匀标记。这是因为不能控制标记核苷酸在多核苷酸中的掺入；这完全取决于待合成多核苷酸的组成。因此，一些多核苷酸可能包含大量标记核苷酸，而其它多核苷酸可能根本不含任何标记核苷酸。结果，这些核酸发出信号的强度将不均一，这样在检测这些核酸时很容易引起结果难以解释。

在该情况下，标记是一种生物标记，人们不能控制标记核苷酸的位置。

文献US-A-5,317,098涉及5’末端标记的核酸。该标记采用咪唑和接头臂。没有相关的片段化。而且，添加了磷酸，因此使用激酶。

然而，理论上核酸的每个游离末端均存在磷酸，导致至少增加一个步骤。该标记不涉及任何片段化。

此外，上两篇文献所述标记是在大的核酸上进行的。实际上，在标记步骤之前没有描述片段化阶段，也称作切割阶段。结果，当对这些靶核苷酸与捕获探针杂交时，杂交后形成的双链不稳定。当使用多核苷酸作为检测探针时，也会出现该情况。原因可能是空间障碍，或者合成的多核苷酸及其大小不一定相同的靶标之间缺乏特异性。因此，这将导致数量和质量上的信号损失。