[发明专利]通过胞质内精子注射进行哺乳动物基因转移

说明书

本申请要求了美国临时专利申请60/096,078(1998年8月11日提交)和60/133,970(1999年5月13日提交)的优先权。

美国政府在本发明中有一个已支付的许可，并且在一定情况下有权根据国立儿童健康与人类发育研究所资助合同No.HD-34362中的条款要求专利所有人以合理的条件许可他人。

                            发明背景

转基因动物对于科学、药物和农业用途很重要。用基因工程改造的牲畜在牛奶中产生外来蛋白被认为是一种适合用于生产治疗性重组蛋白的系统。另外，将人基因插入诸如猪等动物的基因组中就可使这些动物作为活的器官或细胞“工厂”用于生产不会被人免疫系统排斥的人器官或细胞。

现已报道了几种方法通过将外来DNA导入其体细胞和生发细胞来获得转基因哺乳动物。这些方法中有一种是前核显微注射，该方法已被广泛采用，它在1980年代早期首先从小鼠模型发展而成。前核显微注射需要将转基因(tg)DNA注射入单细胞胚的前核中[J.W.Gordon，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77，7380(1980)；J.W.Gordon和F.H.Ruddle，Science 214，1244(1981)；R.D.Palmiter和R.L.Brinster，Annu.Rev.Genet.20，465(1986)；和J.W.Gordon，Int.Rev.Cytol.115，171(1989)]。尽管小鼠中前核合子的产生是简单的，但是对于诸如较大的商用动物品种等动物种类却不一定如此。例如，在牛和猪中，当大量脂质使得合子变得不透明时，合子是难以进行前核注射的基质；相反，小鼠的合子是透明的。

通过DNA构建物转染获得的转基因胚干细胞(ES)已被用于获得牛、羊等的嵌合动物。该方法涉及将携带有所需突变的基因工程改造的ES细胞注射入处于胚胎发育的桑椹胚期(约20-50个细胞)或胚泡期(约100个细胞)的受精胚中。植入后，这些胚胎通常形成嵌合的动物，该动物随后与野生型动物交配，导致ES细胞衍生的基因组的种系传递的频度不同(通常等于0)。由于转基因的效率低且需要大量受体动物进行胚胎转移，因此用该方法很难产生大的转基因动物。

上述的前核显微注射方法和ES细胞转染方法至今均未能得到受控制或预期的tg插入结果，因为异源DNA导入细胞通常会导致不利的“位置”或拷贝数效应，这些效应是由转基因或其多个拷贝整合到宿主基因组中的准随机方式引起的(J.W.Gordon，同上)。因此，这些方法生产大的转基因动物的效率很低。

已经报道，用转染了能同源重组的DNA构建物的小鼠ES细胞系可较好地控制转基因整合的结果[M.J.Evans和M.H.Kaufman，Nature 292，154(1981)；M.Kuehn，等人，同上，326，295(1987)]。这些“基因导向”的ES细胞是这样的细胞，其中一个或多个特异性基因以非常精确的方式经剔除或修饰而不影响整个基因组的其它任何基因座。已经建立了“无限增殖的”转基因ES细胞系，并在体外作了充分地特性鉴定，以确认构建物整合位点。然而，基因导向目前还局限于存在已确定种系贡献的ES细胞系的一种动物—小鼠。

改进哺乳动物种系的现有策略的限制刺激着寻找另一种方法，包括用重组逆转录病毒来感染卵母细胞或植入前的胚胎[D.Jahner，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82，6927(1985)；A.W.S.Chan，等人，同上，95，14028(1998)]，和用复制缺陷型腺病毒介导的输送系统[Y.Kanegae，等人，Nucl.Acids Res.23，3816(1995)]。然而，病毒方案暗示克隆需要额外的步骤，且必须对重组腺病毒和逆转录病毒工程改造需要有专业的防范设施。用这些方法输送病毒还需要显微注射设备或是从卵母细胞中除去透明带。