[发明专利]生产2－酮－L－古洛糖酸的细菌菌株

说明书

                        发明背景

发明领域

本发明涉及用于生产2-酮-L-古洛糖酸的新细菌菌株。本发明进一步涉及通过L-山梨糖的发酵转化生产2-酮-L-古洛糖酸的这些菌株的用途。本发明进一步涉及这些新细菌菌株用于生产吡咯并喹啉醌和无毒脂多糖的用途。对由载体转化的本发明的菌株亦进行了描述。

背景信息

2-酮-L-古洛糖酸(“2-KLG”)在制备必需营养素抗坏血酸(维生素C)中是重要的中间体。过去工业规模合成2-KLG采用了菜氏(Reichstein)法((Helvetica Chimica Acta 17:311(1934))。但是，该方法在商业应用中具有若干缺点，包括使用了大量的溶剂和涉及若干复杂的反应步骤。

因而，为替代菜氏法，发展出了利用一种或多种微生物通过发酵生产2-KLG的方法。例如美国专利2421611公开了如下方法，包括微生物氧化D-葡萄糖为5-酮-D-古洛糖酸、随后化学或微生物还原为L-艾杜酸、随后微生物氧化成2-KLG的方法。日本专利公开文本39-14493、53-25033、56-15877和59-35290公开了类似的方法，例如包括微生物氧化D-葡萄糖为2,5-二酮-D-葡糖酸，接着微生物或化学还原为2-KLG。

但是，因为这些方法也由于一系列缺点而减小了其在商业生产2-KLG中的实用性。例如，这些方法中的化学还原步骤(即将5-酮-D-葡糖酸还原为L-艾杜酸和将2,5-二酮-D-葡糖酸还原为2-KLG)伴随着控制还原的立体化学问题(所以分别生产D-葡糖酸和2-酮-D-葡糖酸作为副产品)，因而减小了2-KLG的产率。另外，当使用一种或多种微生物进行还原，则需要过量的糖提供还原所需的能量，这也减小了2-KLG的产率。

面对这些问题，使用了一种替代途径用于2-KLG的发酵生产，它仅包括将L-山梨糖通过山梨酮中间体氧化为2-KLG。已发展出若干利用这一途径的方法，使用了广泛的如下来源微生物：葡糖杆菌属(Gluconabacter)的例如氧化葡糖杆菌(Gluconabacter oxydans)(美国专利4935359、4960695、5312741和5541108)、假葡糖杆菌属(Pseudogluconobacter)的例如生糖酮假葡糖杆菌(Pseudogluconobactersaccharoketogenes)(美国专利4877735；欧洲专利221707)、假单胞菌属(Pseudomonas)的例如山梨糖氧化假单胞菌(Pseudomonassorbosoxidans)(美国专利4933289和4892823)和来自这些和其它属的微生物，例如醋杆菌属(Acetobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙雷氏菌属(Serratia)、分枝杆菌属(Mycobacter)和链霉菌属(Streptomyces)(美国专利3912592、3907639和3234105)

但是，因为这些方法存在某些缺点限制了其用于商业生产2-KLG中的实用性。例如上述使用氧化葡糖杆菌的方法，为了生产足够高水平的商业用途的2-KLG需要存在附加的“辅助”微生物菌株，例如巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterrium)，或者需要导致商业上没有吸引力的酵母或来自酵母的生长成分的量。类似地，对使用假葡糖杆菌属的方法，为了获得商业上合适的2-KLG浓度和山梨糖底物的有效使用，需要在培养基中补充昂贵的和不常用的稀土盐或者存在辅助菌株例如巨大芽孢杆菌，和/或存在酵母。对使用山梨糖氧化假单胞菌的其他方法，也需要在培养基中含有商业上没有吸引力的酵母或酵母提取物的量。 

吡咯并喹啉醌(PQQ)(2,7,9-三羧基-1-H-吡咯并[2,3-f]喹啉-4,5-二酮)最初是从甲基营养菌(利用甲醇的)的培养物中分离出来，以后发现它在许多动物组织中存在。PQQ的结构如下：

PQQ可能是一种新的维生素，因为据信其对正常的生长和发育是必需的。当作为补充成分喂养动物时，PQQ防止通常情况下发生的氧化性改变。此外，PQQ能增加小鼠星形神经胶质细胞中神经生长因子的合成，且在大脑中具有治疗功能的潜力。(Bishop等人。“吡咯并喹啉醌：一种新维生素”。营养综述(Nutrition Reviews)56:287-293(1998))

有机化学合成是生产PQQ的常规方法。但是，有机化学合成具有若干缺点。例如，由于合成需要许多并且有时是复杂的反应步骤，生产得率低，所以化学合成不经济并消耗时间。