[发明专利]酶原性核酸的检测方法,以及相关分子和试剂盒

权利要求书

1．一种检测样品中目标核酸序列存在的方法，其特征在于，包括：

(a)在允许引物起始的核酸扩增和催化性核酸活性的条件下，和样品接触，使用

(ⅰ)适合起始目标扩增的DNA引物，和

(ⅱ)编码催化性核酸分子，但本身是反义序列的DNA酶原，其中引物和酶原相互关联定位，从而在目标存在时，产生含有目标和催化性核酸分子序列的单扩增核酸分子；以及

(b)测定催化性核酸活性，从而测定样品中的目标核酸序列的存在。

2．如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤：定量测定从步骤(a)得到的样品中催化性核酸活性量，并将由此得到的活性量和已知标准比较，从而对目标核酸序列进行定量。

3．如权利要求1所述的方法，其特征在于，引物和酶原基因在不同的DNA分子上，而引物起始的核酸扩增是滚环扩增。

4．如权利要求1所述的方法，其特征在于，样品和两个DNA分子接触，每个分子都含有引物，至少一个分子含有酶原基因，其中引物在酶原基因的3′端。

5．如权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(a)(ⅱ)产生的单扩增核酸分子进一步含有被共同位于扩增分子上的酶原基因编码的催化性核酸识别并顺式切开的核苷酸序列。

6．如权利要求5所述的方法，其特征在于，酶原基因编码的催化性核酸是10-23 DNA酶，而在步骤(a)(ⅰ)中使用的DNA引物含有至少一个嘌呤核糖核苷酸残基，该残基作为被10-23 DNA酶识别并顺式切开的位点的5′端。

7．如权利要求4所述的方法，其特征在于，至少有两个DNA分子同时含有引物和酶原基因。

8．如权利要求1所述的方法，其特征在于，目标核酸序列是DNA分子。

9．如权利要求1所述的方法，其特征在于，目标核酸序列是RNA分子，而步骤(a)进一步包括在用引物和酶原基因接触样品前，将目标核酸序列，若存在，反转录成DNA的步骤。

10．如权利要求1所述的方法，其特征在于，催化性核酸分子是核酶。

11．如权利要求1所述的方法，其特征在于，催化性核酸分子是DNA酶。

12．如权利要求1所述的方法，其特征在于，催化性核酸活性包括可检测的化学底物的修饰，该修饰选自磷酸二酯键的形成和切开，核酸连接和切开，卟啉金属化，和碳-碳、酯和胺键的形成。

13．如权利要求12所述的方法，其特征在于，可检测的化学底物修饰是荧光标记的核酸分子的切开。

14．如权利要求13所述的方法，其特征在于，荧光标记的核酸分子是DNA/RNA嵌合体。

15．如权利要求1所述的方法，其特征在于，目标核酸序列来自选自人类、细菌、支原体和病毒的有机体。

16．如权利要求15所述的方法，其特征在于，目标核酸序列来自人类。

17．如权利要求16所述的方法，其特征在于，样品中的目标核酸序列的存在是遗传疾病。

18．如权利要求1所述的方法，其特征在于，样品是法医学样品。

19．一种同时检测样品中多种目标核酸序列存在与否的方法，其特征在于，包括

(a)在允许引物起始的核酸扩增和催化性核酸活性的条件下，和样品接触，使用

(ⅰ)多个引物，其中对于每个要检测的目标，存在至少一个适合起始该目标扩增的引物，和

(ⅱ)多个酶原基因，其中对于每个要检测的目标，存在至少一个编码具有明显的可测定的活性的催化性核酸分子，但本身是反义序列的酶原基因，引物和酶原基因相互关联定位，从而当相应目标存在时，产生含有目标和相应的催化性核酸分子序列的单扩增核酸分子；以及

(b)同时测定每个催化性核酸活性的存在与否，从而测定样品中的每个相应的目标核酸序列的存在。

20．如权利要求19所述的方法，其特征在于，进一步包括步骤：定量测定从步骤(a)得到的样品中每个催化性核酸活性，并将由此得到的每个活性量和已知标准比较，从而对每个目标核酸序列进行定量。