[发明专利]酶原性核酸的检测方法,以及相关分子和试剂盒

说明书

在本申请中引用了不同的出版物。这些出版物的内容在此申请中引用以供参考，以描述本发明涉及的更全面的技术领域。

发明领域

本发明涉及通过核酸扩增来检测和定量样品中的目标核酸分子的方法。在本方法中，产生一条含有催化性核酸和目标序列的单扩增子。催化性核酸仅在目标存在时从它的反义的酶原性的前体中合成。

发明背景

体外核酸扩增的方法在遗传学、疾病诊断和法医学中有广泛应用。在过去的十年中，许多扩增已知核酸序列(“目标序列”)的技术已被描述。这些包括多聚酶链式反应(“PCR’)(1-7,41)，链置换扩增法(“SDA”)(8)和转录调节扩增(“TMA’)(9,10)(也作为自动维持序列复制(“SSR”)为人所知)。PCR和SDA产生的扩增产物(“扩增子”)为DNA，而RNA扩增子由TMA产生。这些方法产生的DNA或RNA扩增子可被用作和遗传疾病有关的核酸序列的标记物。

几个方法都可在封闭系统中，亦即，在单一的同源反应系统中同时扩增和检测核酸序列。这些方法包括Sunrise^TM引物(11)，分子标记(12)和Taqman^TM系统(13)。使用同源封闭试管形式比在扩增反应后，分别分析扩增子有几个优点。由于需要更少的操纵步骤，封闭系统方法更快、更简便。封闭系统减少了和从其它反应得到的扩增子的污染有关的假阳性的可能性。同源反应可以实时监控，而0时的信号可测量系统的背景信号。因此不需要另外的减少背景信号的对照反应。信号强度的改变指示在样品中存在特异性的核酸序列的扩增。

替换策略包括扩增报道基因的信号，而不是扩增目标核酸。分枝DNA测定法(14)通过使用二级报道分子(例如，碱性磷酸酶)扩增信号，而荧光相关光谱学(FCS)使用信号的电放大(15)。

采用其它的扩增技术，催化性核酸已在近年来被深入研究。作为治疗剂，用催化性核酸抑制基因功能的可能性在文献中被广泛讨论(16-22)。催化性RNA分子(“核酶”)已被显示能催化磷酸二酯键的形成和切开(16,23)。用体外进化技术已发现其它能催化范围广泛得多的反应的核酸，包括核酸的切开(21,22,24)和连接(25)，卟啉金属化(26)，和碳-碳(27)、酯(28)和胺(29)键的形成。

核酶已显示能切开RNA(16)和DNA(21)的分子。相似的，催化性DNA分子(“DNA酶”)也显示能切开RNA(17,24)和DNA(22,30)分子。催化性核酸能切开目标核酸底物，使该底物符合严紧序列要求。目标底物要和催化性核酸的杂交区域互补，并在切割位点含有特异性的序列。切割位点的序列要求的例子包括：对一类DNA酶的嘌呤：嘧啶序列要求(“10-23”模型或“10-23 DNA酶”)(24)，和对锤头核酶的U:X序列要求，其中X可以是A,C或U，但不能是G(16)。

除了有治疗潜力外，催化性核酸分子还能用作基因诊断方法中的分子工具。例如，核酶已在二阶段方法中用于促进信号放大(31-33)。在第一阶段中，测试样品和非活性的寡聚核苷酸接触。接触导致在样品含有目标序列时，“触发”RNA寡聚核苷酸的产生。在第二阶段中，触发RNA寡聚核苷酸诱导放大级联。该级联导致大量催化活性的报道核酶的产生，当它们被检测到时，指示在测试样品中存在目标序列。在过程中，目标序列本身不被扩增。更确切的，仅报道信号被扩增。

总之，目标核酸扩增和允许的反应条件都是已知的。催化性核酸分子，和它们的活性的允许反应条件也是已知的。

然而，允许核酸扩增的同时过程和在单一反应内部环境中的催化性核酸活性的方法不存在。而且，目标扩增方法，其中扩增产物是含有目标和催化性核酸分子序列的单核酸分子，不曾被施行过。最后，没有目标扩增方法曾使用催化性核酸分子的反义酶原性序列，它仅在目标序列存在时，才以它的“有义”，催化性形式扩增。

发明简介

本发明提供了检测样品中目标核酸序列存在的方法，其中包括

(a)在允许引物起始的核酸扩增和催化性核酸活性的条件下，和样品接触，使用

(ⅰ)适合起始目标扩增的DNA引物，和

(ⅱ)编码催化性核酸分子，但本身是反义序列的DNA酶原，其中引物和酶原相互关联定位，从而在目标存在时，产生含有目标和催化性核酸分子序列的单扩增核酸分子；以及

(b)测定催化性核酸活性，从而测定样品中的目标核酸序列的存在。

本发明还提供同时检测样品中多种目标核酸序列存在与否的方法，其中包括

(a)在允许引物起始的核酸扩增和催化性核酸活性的条件下，和样品接触，使用