[发明专利]干扰素－β－1α的聚合物缀合物及其使用

说明书

                发明背景

多肽和蛋白质在特殊疾病的全身性治疗中的使用现在已经被医学实践所接受。这些物质在治疗中的作用非常重要，以至于许多研究活动正致力于通过重组DNA技术大量合成。这些多肽中的许多种是非常有潜力且可特异诱发其生物学作用的内源性分子。

限制这些蛋白质性质的物质用于期望应用的主要因素是，当非胃肠给药时，它们在短时间内由体内消除。这可能是蛋白酶代谢的结果，或者是通过蛋白质消除常规途径(诸如肾的过滤)而被清除。由于胃中的蛋白水解作用和强酸性，在这些物质到达靶组织前就把它们破坏了，所以施用它们的口服路线甚至更有问题。制药业对于这些蛋白质施用路线的相关问题是熟知的，而且正在尝试各种策略解决它们。

已经发表了与蛋白质稳定化有关的大量工作。已知将蛋白质与聚合物物质缀合的多种方法，包括使用葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、糖肽、聚乙二醇和聚氨基酸。据报道，产生的缀合多肽保留了它们的生物学活性和在非胃肠应用用水中的可溶性。

干扰素是许多临床工作和以改进其施用和生物同化为目的的努力所关注的肽家族。干扰素已经在多种临床疾病状态中进行了测试。人干扰素β(该家族成员之一)的使用在多发性硬化症中得到了最好的确认。最近，在欧洲和美国，重组干扰素β的两种形式获得了用于此疾病治疗的许可。一种形式是干扰素-β-1a(商标AVONEX,mfg.Biogen公司，Cambridge,MA)，此后可互换使用“干扰素-β-1a”或“[FN-β-1a”。另一种形式是干扰素-β-1b(商标BETASERON,Berlex,Richmond,CA)，此后使用“干扰素-β-1b”表示。干扰素-β-1a是使用天然人类基因序列在哺乳动物细胞中生产的，并进行了糖基化；而干扰素-β-1b是使用经修饰人类基因序列(在第17位氨基酸位置经基因工程改造用丝氨酸取代半胱氨酸)在大肠杆菌中生产的，而且未进行糖基化。

以前，我们中的一些人直接比较了干扰素-β-1a和干扰素-β-1b在功能性实验中的相对体外潜力，结果显示，干扰素-β-1a的比活性比干扰素-β-1b的比活性高大约10倍(Runkel等人，药物研究(Pharm.Res.)15:641-649,1998)。根据设计用来鉴定这些活性差异的结构基础的研究，我们确认了，糖基化是产物间影响比活性的唯一的已知结构差异。碳水化合物的影响很大程度上是通过其对结构的稳定化作用而显现的。碳水化合物的稳定化作用在热变性实验和SEC分析中是明显的。糖基化的缺乏还与聚集的增加和热变性敏感性的增加有关。用PNG酶F由干扰素-β-1a通过酶方法除去碳水化合物，将引起去糖基化产物的广泛沉淀。

这些研究表明，尽管干扰素-β-1a和干扰素-β-1b之间存在序列保守性，但是它们是不同的生化实体，由此关于干扰素-β-1b已知的许多知识不能应用于干扰素-β-1a，反之亦然。

发明概述

我们利用了糖基化干扰素β相对于非糖基化形式的优势。具体而言，我们发展了干扰素-β-1a组合物，该组合物相对于干扰素-β-1b具有增高的活性、并具有PEG化蛋白质普遍具有的医疗特性，而且相比于干扰素-β-1a非缀合形式其活性没有有效损失。因此，如果进行修饰后的产物(聚合物-干扰素-β-1a缀合物)保留了所有或大部分生物学活性，则可能产生下列特性：导致半衰期增加和组织分布变化的药物动力学和药效动力学变化(如在血管中维持更长时间的能力)、溶液中的稳定性增加、免疫原性降低、保护免受蛋白水解消化和随后的活性消除。这种制剂是制药和医学领域的实质性进步，并将对干扰素具有一些效用的各种疾病(诸如多发性硬化症、纤维变性、和其它炎症性或自身免疫疾病、癌症、肝炎和其它病毒性疾病)的治疗作出显著贡献。具体而言，在血管中维持更长时间的能力使得干扰素-β-1a能够用于抑制血管生成并潜在通过血脑屏障。此外，当配制干扰素-β-1a粉剂形式用于随后的吸入施用时，通过产生聚合物-干扰素-β-1a缀合物得到的热稳定性是有利的。

我们根据干扰素-β-1a的结晶学结构的知识，发展了干扰素-β-1a-聚合物缀合物，其中聚合物在干扰素-β-1a上的连接位点使得缀合物保留了相对于非缀合干扰素-β-1a的全部干扰素-β-1a活性。

本发明的一个方面是缀合的干扰素-β-1a复合物，其中干扰素-β-1a与将聚亚烷基二醇作为完整部分掺入的聚合物共价键合。