[发明专利]转基因表达调控的新系统

说明书

本发明涉及控制细胞中核酸表达的新组合物和方法。本发明更具体地适于控制体外及体内神经细胞中的核酸表达。

控制细胞中的核酸表达在生物技术的所有领域中都有巨大的吸引力。这样可以在体外或离体改善重组蛋白的表达条件、对基因功能或调节的研究、病毒颗粒的生产、用于植入体内之细胞的制备等。在体内，这可以改善动物模型的特性、更精确地研究化合物的生物利用度或毒性或基因的功能、或更有效地控制化合物的生产，例如治疗或疫苗目的的化合物。本发明的组合物和方法可用于所有这些生物技术领域。

现有技术中已提出了各种途径试图控制基因表达。这特别涉及利用具有组织特异性的载体或转录启动子。但这些系统不总具有所期望的特异性，特别是在体内，而且它们不能在时间上控制表达。

Gossen等(PNAS 89(1992)5547；Science 268(1995)1766)描述了一种复杂的系统，其一方面利用四环素调控的反式激活蛋白tTA，另一方面利用tTA敏感的启动子。虽然提供了时间上调控表达方面的优点，迄今报道的这种系统总有一些缺陷限制其应用。这些缺陷特别是细胞毒性、所观察到的表达渗漏、需要使用两种载体等。

本发明现提供一种与现有技术系统相比稳定性、特异性和易操纵性改善的受控新表达系统。

因此，本发明的第一方面涉及含有如下元件的基因构建体，所述元件的性质和特定布置能保证基因表达的严格控制。

本发明的另一方面涉及含有这些遗传构建体的载体，特别是病毒载体。

本发明的另一方面涉及用本发明遗传构建体或载体遗传修饰的细胞、含有这些细胞的组合物、以及它们用于体外、离体或体内生产目的产物的应用。

本发明的另一方面涉及在体外、离体或体内细胞中受控表达核酸的方法和组合物，特别是在神经细胞中。本发明的另一方面还涉及在体内受控转移和表达核酸的方法，包括体内植入(或移植)用本发明构建体或载体遗传修饰的细胞(特别是神经祖细胞)。

本发明更具体地描述一种基于使用tTA并具有改善特性的新的受控表达系统。该系统在腺病毒的情形下特别有效，能在体外及体内有效和受调节地表达，特别是在神经系统中。

本发明的另一个目的更具体地涉及一种核酸，其特征在于它包含：

a)含中等启动子控制下之四环素调控系统反式激活蛋白tTA编码核酸的第一区，和

b)含tTA敏感性启动子控制下之目的核酸的第二区，其中a)和b)两个区以相同的转录方向放置。

更优选，本发明的核酸另外包含置于a)和b)两个区之间的第三个区c)，其限制a)和b)区间的转录干扰。

本发明实际上基于，证明了这种构建体特别在控制体内基因表达、特别是控制神经细胞中表达的有利特性。本发明还表明这些构建体的有利特性部分来自各种遗传元件的选择和其间的布置。

因此，在本发明核酸的a)区中，用于控制反式激活蛋白tTA基因表达的启动子是一种中等启动子。“中等启动子”在本发明中指本领域技术人员认为其活性水平中等的启动子，即活性低于强启动子。更具体地讲，本发明中的中等启动子是能使得以生理水平表达的非病毒启动子。

因此，与现有技术(Gossen等，PNAS 89(1992)5547)中描述的系统不同(其中所用启动子是强病毒启动子(特别是hCMV))，本发明的构建体使得以对哺乳动物非毒性的水平组成性合成反式激活蛋白tTA。申请人现证明在细胞中保持中等水平的tTA可以获得对基因表达的精细得多的调节，特别是在神经细胞中。

更优选地，所用启动子是一种细胞启动子，即来自在细胞中表达之基因的启动子。有利地，该启动子的来源(衍生)细胞与待引入该遗传构建体的细胞来自相同的物种。因此，当本发明的构建体用于在动物中引入核酸时，所用的中等细胞启动子优选衍生自该相同动物种的细胞，或衍生自相关或相近物种的细胞。当然，可能利用衍生自不同生物的启动子，例如一种鼠启动子用于人体中的表达，只要所用的启动子是功能性的。

更优选，所用的启动子是一种组成型中等细胞启动子。本申请实际上表明，当所用启动子是组成型时获得本发明系统的最佳特性，组成型即保证细胞中存在并维持稳定的tTA水平。