[发明专利]用于预防和治疗贫血的方法以及组合物

说明书

发明领域

本发明涉及应用高糖基化红细胞生成素类似物提高哺乳动物血细胞比容。更具体地说，本发明涉及较低频度给予高糖基化类似物(与重组人红细胞生成素相比)以提高以及维持血细胞比容并治疗贫血。本发明还涉及以相同给药频率给予较低剂量高糖基化类似物(与重组人红细胞生成素相比)以提高以及维持血细胞比容并治疗贫血。还提供新的高糖基化红细胞生成素类似物。

发明背景

红细胞生成素(Epo)是红细胞类祖细胞成熟为红细胞必需的糖蛋白激素。它在肾脏产生，主要调节循环红细胞水平。特征为低水平组织氧体征的情况增加Epo产生，它再刺激红细胞生成。例如见于慢性肾功能衰竭(CRF)的肾功能障碍通常导致Epo产生减少，同时红细胞减少。

Miyake等(J.Biol.Chem.252，5558(1977))从再生障碍性贫血患者纯化人尿Epo。但是，从该来源获得的纯化Epo蛋白量不足以进行治疗应用。Lin在美国专利第4,703,008号中公开了鉴定以及克隆编码人Epo的基因以及表达重组蛋白，该专利公开内容通过引用结合到本文中。Lai等在美国专利第4,667,016号中公开了从细胞培养基纯化重组人红细胞生成素的方法，将其通过引用结合到本文中。已由哺乳动物宿主细胞产生生物活性Epo，首次获得适合治疗用途的Epo量。此外，对所述基因序列的了解以及纯化蛋白的生物利用度提高使得可以更好地了解该蛋白的作用模式。

人尿来源的Epo(Miyake等，同上)和在哺乳动物细胞中表达的重组人Epo均含有3个N-联和1个O-联寡糖链，它们一起约占所述糖蛋白总分子量的40％。N-联糖基化发生于位于位置24、38和83的天冬酰胺残基，而O-联糖基化发生于位于位置126的丝氨酸残基(Lai等，J.Biol.Chem.261，3116(1986)；Broudy等，Arch.Biochem.Biophys.265，329(1988))。已经证实所述寡糖链在末端被唾液酸残基修饰，通常N-联链最高每链可含有4个唾液酸，而O-联链最高可含有2个唾液酸。所以Epo多肽最高总共可以接纳14个唾液酸。

各种研究已经表明，改变Epo糖链可影响生物活性。然而在一个研究中，单独去除N-联或O-联寡糖链或者通过诱变为糖基化位点的天冬酰胺或丝氨酸残基一起去除N-联或O-联寡糖链明显降低在哺乳动物细胞中产生的改变的Epo的体外活性(Dube等，J.Biol.Chem.263，17516(1988))。然而，DeLorme等(Biochemistry 31，9871-9876(1992))报道去除Epo N-链糖基化位点降低体内生物活性而不是体外生物活性。

通过测定分离的Epo同种型的体内活性可揭示Epo唾液酸含量和其体内生物活性的关系。以等摩尔浓度的分离的Epo同种型提高正常小鼠的血细胞比容的能力测定，发现每个Epo分子的唾液酸含量逐渐提高导致相应的Epo体内生物活性逐渐提高(Egrie等，GlycoconjugateJ.10，263(1993))。此外，具有较高唾液酸含量的Epo同种型的血清半衰期更长，但是与Epo受体的亲和力降低，提示血清半衰期是体内生物活性的重要决定因素。

在Epo多肽中导入新的糖基化位点可产生具有额外糖链的分子。参见PCT公开号WO91/05867和WO94/09257，将其通过引用全部结合到本文中。公开了具有至少一个额外N-联糖链和/或具有至少一个额外O-联糖链的Epo糖基化类似物。测定发现，与重组人Epo(rHuEpo)(同种型9-14)和每个分子含有14个唾液酸的纯化同种型rHuEpo相比，含有一个额外N-联链的糖基化类似物的循环半衰期更长。