[发明专利]微生物快速分型方法及所用试剂盒

摘要

本发明公开了快速分型酵母、寄生虫和细菌的方法。该方法包括以下步骤：a)利用只包含缓冲液、去污剂、螯合剂和氢键断裂试剂的试剂盒的方法，在5-60分钟内制备完整的固定化DNA。b)利用CHEF(Contour Clamped Homogeneous Electric Field)和TAFE(Transversal Alternating Field Electrophomsis)系统的脉冲场电泳微型设备，在2.5-7小时内分离完整的DNA分子或其限制性片段。c)通过预先模拟该凝胶中将得到的电泳图的方法，选择miniCHEF应用的最适条件。d)不需利用大小标志，而是利用分析迁移距离的方法，提供重定向时间、迁移速度和分子大小。

主权项

1. 利用脉冲场凝胶电泳(PFGE)的细菌快速分型方法；该方法在7-13小时内进行，包括在CHEF(Contour Clamped HomogeneousElectric Field)系统的微型槽内进行细菌DNA限制性片段的分离和通过在一组已知的理论公式中代入DNA大小‘L’、电场‘E’、缓冲液粘度‘η’和脉冲时间计算所述片段在不同脉冲时间tp时在1.5％琼脂糖凝胶、0.5×TBE缓冲液中的DNA迁移‘D’，其中0.5×TBE缓冲液为44.5mMTris、44.5mM硼酸、1mM EDTA、pH 8.3，且该已知理论公式表示为其中‘d’表示每次脉冲的迁移，计算为dr＝vr·tpr·Γr(tpr-tr)+vm·(tpr-tr)·[1-Γr(tpr-tr)]，vr是DNA重定向速度，计算为vr＝0.0207[QE1.45/(8πηL1.35)]，‘vm’是重定向后的DNA速度，计算为vm＝0.665[QE1.76/8πηL1.08]，‘tr’是DNA重定向时间，计算为tr＝0.134(L1.14/vr)0.926；如果(tp-tr)≤0则Γr(tpr-tr)＝1，而如果(tpr-tr)>0则Γr(tpr-tr)＝0，其中缓冲液粘度‘η’计算为缓冲液温度的函数，‘n’是脉冲时间斜坡数，‘Np’是脉冲数；该方法包括：a)如下制备大肠杆菌、铜绿假单孢菌或金黄色葡萄球菌细胞的固定化完整DNA的步骤：i)在仅由化学试剂组成的最多5种不同的溶液中依次温育各细菌种的细胞和DNA分子，所述溶液选自以下7种：-0. 15M NaCl盐和0.01M金属螯合剂EDTA，pH 8.0，该溶液称为溶液1，-0. 15M NaCl，该溶液称为溶液2，-悬浮在0. 15M NaCl溶液中的1.5％低熔点琼脂糖，该溶液称为溶液3，-悬浮在由0. 15M NaCl和0.01M金属螯合剂EDTA组成且pH为8.0的溶液中的1.5％低熔点琼脂糖，该溶液称为溶液4，-0. 1M金属螯合剂EDTA，浓度均为1％的2种阴离子去污剂十二烷基肌氨酸钠和Nonidet P-40，和0.01M Tris碱，pH 8.0，该溶液称为溶液5，-0. 1M金属螯合剂EDTA，浓度均为1％的2种阴离子去污剂十二烷基肌氨酸钠和Nonidet P-40，0.01M Tris碱，和4M脲，pH9. 5，该溶液称为溶液6，-0. 1M金属螯合剂EDTA和0.01M Tris碱，pH8.0，该溶液称为溶液7，ii)用于灌注包含细菌细胞的琼脂糖微胶块的柔软模具；该模具为聚硅氧烷的薄片，并盖有玻璃盖子；该薄片厚达0.5cm，并在其一个表面印有多个大小为0.3cm、深度为0.03至0.1cm的方形凹槽，琼脂糖-细菌细胞混合物在凹槽中固化，形成所述大小的微胶块，所述模具足够柔软，能够弯曲而从中分离出所述的微胶块，并且能在灭菌后重新使用，所述的模具和盖子进行组装用于灌注包含固定化的细菌细胞的微胶块，iii)灌注含有所述细菌种之一的被包埋的细胞的微胶块、从模具上分离所述微胶块、以及通过所述在仅由化学试剂组成的最多5种溶液中的依次温育来处理所述细胞和DNA分子的步骤；b)在微型槽中分离所述细菌种的DNA限制性片段之前进行的计算步骤，借助该步骤选择出miniCHEF运行的最适电泳条件，该步骤由一计算方法完成，其包含：i)针对电场1-20V/cm和温度4-30℃输入细菌DNA限制性片段的‘d’、‘tr’、‘vr’和‘vm’的数据设置，这些数据设置值是通过在描述‘tr’、‘vr’、‘vm’和‘d’的已知理论公式组中代入DNA大小、电场和温度而获得的，ii)计算斜坡脉冲的持续时间，或最有效分离DNA分子的脉冲持续时间系列，iii)计算总的运行时间，或针对步骤(ii)计算的脉冲持续时间系列计算最有效的电泳运行时间，iv)针对所述的最适电泳条件或最有效脉冲持续时间斜坡和运行时间计算条带示意图，该图是此方法的计算结果，其特征在于条带以按DNA迁移分开的不同颜色的线绘制；示意图中每一颜色表征特定大小的限制性片段；由此明确的颜色代码确认了片段的大小，根据几个步骤进行每一计算；由几项形成序列或斜坡，其中一项是脉冲持续时间‘tp’，一项附有给出最有效运行持续时间的相应脉冲数‘Np’。