[发明专利]一种动物源细菌四环素类药物耐药基因多重PCR检测技术

摘要

本发明涉及一种动物源细菌四环素类药物耐药基因多重PCR检测技术，该方法包括扩增待测细菌耐药基因的三对PCR引物以及PCR模板制备试剂和细菌耐药基因多重PCR扩增试剂，利用该多重PCR检测技术能扩增待测菌株四环素类药的耐药基因。它具有灵敏度高、特异性高、应用范围广，结果准确可靠的特点。

主权项

1. 一种动物源细菌四环素类药物耐药基因多重PCR检测方法，包括以下步骤：[1]PCR模板的制备方法如下：(1)LB培养基摇瓶培养增菌，包括动物粪样、组织液、血液或其它体液；(2)取1ml经LB培养基摇瓶培养3-6h的菌液于无菌1.5mlEP管中，8000r/min离心3min，弃上清，再加入1mlPCR模板制备试剂洗涤液，重复离心一次，弃上清，最后加入50-200ulPCR模板制备试剂样品处理液，震荡混匀后备用；[2]动物源细菌四环素类药物耐药基因多重PCR扩增试剂的配制方法如下：(1)根据现有方法合成耐药基因tetA、tetC、tetM特异性引物，所述特异性引物序列如下：tetA：For：5’-GGCACCGAATGCGTATGAT-3’Rev：5’-AAGCGAGCGGGTTGAGAG-3’tetC：For：5’-CTGGGCTGCTTCCTAATGC-3’ Rev：5’-AGCTGTCCCTGATGGTCGT-3’tetM：For：5’-GAGGTCCGTCTGAACTTTGCG-3’Rev：5’-AGAAAGGATTTGGCGGCACT-3’用1mmol/L Tris.Hcl-0.1mmol/L EDTA缓冲液稀释上述引物，使其浓度为25mmol/L；(2)取10倍PCR缓冲液，浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP混合物，浓度为25mM/L的MgCl2，浓度均为25mmol/L的三种耐药基因即tetA基因、tetC基因、tetM基因的上述特异性上下游引物，浓度为2.5U/μL的Taq DNA聚合酶和超纯水装入一无菌的PCR反应薄壁管中；[3].动物源细菌四环素类药物耐药基因多重PCR检测方法中试剂的组成：(1)取10倍PCR缓冲液5μl，浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP混合物4μl，浓度为25mM/LMgCl25μl，浓度为2.5U/ULTaq DNA聚合酶0.35μl，浓度均为25mmol/L的三种耐药基因即tetA基因、tetC基因、tetM基因的上述特异性上下游引物分别1.0μl、0.3μl、0.4μl于一无菌的PCR反应薄壁管中；(2)加入已制备好的模板5μl，补水至总体积50μl后加入20μl矿物油封顶即可；[4].PCR扩增循环参数为：(1)94℃预变性5min；(2)然后进入循环：94℃变性60s、56℃退火60s、72℃延伸90s，共35个循环，最后72℃延伸10min后，取出于4℃保存；[5]耐药基因检测结果判定(1)取5μl PCR产物，与1μl Loading buffer混匀后，点样于2％琼脂糖凝胶电泳板孔中，80V电压，电泳40min，于紫外荧光成相仪下拍照判定，如果可见480bp、580bp、910bp的条带，分别指示tetA基因、tetC基因、tetM基因的存在；(2)直接测序鉴定法：将经过纯化的PCR产物50μl和20μl三基因的上下游引物一起进行DNA测序。