[发明专利]一种应用多重PCR快速检测致病性溶藻弧菌的方法

摘要

一种应用多重PCR快速检测致病性溶藻弧菌的方法，利用致病性溶藻弧菌外毒素基因保守区设计三对引物，建立多重PCR的快速准确的检测方法，取被感染致病性溶藻弧菌的水产养殖动物病灶组织匀浆，将匀浆的病灶组织加入TSB培养基在28℃140r/min摇床上培养18h，水煮法提取DNA作模板，应用三对引物组成的多重PCR方法进行检测，电泳结果出现三个片段，大小分别为424、319、173bp，而应用该法检测非溶藻弧菌感染的水产养殖动物结果则呈阴性。该方法特异性高，操作方便，检测成本低，检测时间短，可以标准化为产品，能够进行大批量样品检测，可以满足有关质检部门、养殖企业、研究单位等批量检测水产养殖动物体内致病性溶藻弧菌的需要。

主权项

1.一种应用多重PCR快速检测致病性溶藻弧菌的方法，其特征是按以下步骤；(1)DNA模板提取：①取具有弧菌病症状的水产养殖动物病灶组织心、肝、脾、肾和溃疡部位等，匀浆，取匀浆液1.5mL，10000g离心10min，沉淀用双蒸水悬浮，再10000g离心10min，将沉淀悬浮于1mL双蒸水中，在沸水中煮8～10min，10000g离心10min，其上清液即为DNA模板；②取未具有弧菌病症状水产养殖动物组织心、肝、脾、肾和肌肉等，匀浆，加入TSB培养基在28℃140r/min摇床上培养18h，取匀浆液1.5mL，10000g离心10min，沉淀用双蒸水悬浮，再10000g离心10min，将沉淀悬浮于1mL双蒸水中，在沸水中煮8～10min，10000g离心10min，其上清液即为DNA模板；(2)多重PCR三对引物分别为：A：5′-TGGTGAACAGCCAGTAAA-3′，5′-CAAACCCATCATAAGTAGTC-3′B：5′-GGCGGTCGCTCTGGTATT-3′，5′-TTGCCATCGTAAGTGCTGTA-3′C：5′-CAGAAGAATCGGAAGAACA-3′，5′-TAGAATGACGCACAAAGG-3′；(3)多重PCR反应体系为：10×PCR buffer 2.5μl(已加Mg2+，终浓度为1.5 mmol/L)dNTP mixture 2μL(终浓度0.25mmol/L)引物 上下游各2μL(终浓度0.5μmol/L)DNA模板 1μL(约0.1μg)ExTaq 1μL(终浓度2U)ddH2O 14.5μL总体积 25μL(4)多重PCR反应条件为94℃ 5min；65℃ 1min；72℃ 1.5min，共30个循环，72℃ 10min；(5)取10μL多重PCR反应液进行DNA琼脂糖凝胶电泳，其中凝胶胶浓度为0.8-1.2％。