[发明专利]在两个功能性亚结构域中具有突变的LAGLIDADG归巢核酸内切酶变体及其用途有效
| 申请号： | 200680039566.9 | 申请日： | 2006-10-03 |
| 公开（公告）号： | CN101310015A | 公开（公告）日： | 2008-11-19 |
| 发明（设计）人： | 弗雷德里克·帕克 | 申请（专利权）人： | 赛莱克蒂斯公司 |
| 主分类号： | C12N9/22 | 分类号： | C12N9/22;C12N15/55;C12N15/64;C12N15/10;C12N15/79;C12N15/82 |
| 代理公司： | 北京集佳知识产权代理有限公司 | 代理人： | 刘晓东;顾晋伟 |
| 地址： | 法国罗*** | 国省代码： | 法国;FR |
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| 摘要： | LAGLIDADG归巢核酸内切酶变体，其在两个单独的亚结构域中具有突变，其中每个亚结构域与经修饰的DNA靶标半位点的不同部分结合，所述LAGLIDADG归巢核酸内切酶变体能够切割包含与每个亚结构域结合的核苷酸的嵌合DNA靶序列。所述异源二聚大范围核酸酶及其衍生产物用于遗传工程、基因组治疗和抗病毒治疗的用途。 | ||
| 搜索关键词： | 两个 功能 结构 域中 具有 突变 laglidadg 归巢 核酸 内切酶 变体 及其 用途 | ||
【主权项】：
1.通过突变核心结构域的两个功能性亚结构域，改造亲本LAGLIDADG归巢核酸内切酶得到LAGLIDADG归巢核酸内切酶变体的方法，其至少包括以下步骤：(a)构建第一变体，其在所述核心结构域的第一功能性亚结构域中具有突变，所述第一功能性亚结构域与所述亲本LAGLIDADG归巢核酸内切酶切割位点的一半的第一部分相互作用，所述构建通过以下步骤实现：(a1)用不同的氨基酸替换第一亚结构域的至少一个氨基酸，所述第一亚结构域对应位于I-CreI中26至40位的亚结构域，(a2)通过用不同的核苷酸替换所述半位点第一部分的至少一个核苷酸来选择和/或筛选步骤(a1)的第一变体，其能够切割来源于所述亲本LAGLIDADG归巢核酸内切酶半位点的第一DNA靶序列，(b)构建第二变体，其在所述核心结构域的第二功能性亚结构域中具有突变，所述第二功能性亚结构域与所述亲本LAGLIDADG归巢核酸内切酶半位点的第二部分相互作用，所述构建通过以下步骤实现：(b1)用不同的氨基酸替换第二亚结构域的至少一个氨基酸，所述第二亚结构域对应位于I-CreI中44至77位的亚结构域，(b2)通过用不同的核苷酸替换所述半位点第二部分的至少一个核苷酸来选择和/或筛选步骤(b1)的第二变体，其能够切割来源于所述亲本LAGLIDADG归巢核酸内切酶半位点的第二DNA靶序列，(c)构建第三变体，其在所述亲本LAGLIDADG归巢核酸内切酶的所述第一和第二功能性亚结构域中具有突变，所述构建通过以下步骤实现：(c1)将步骤(a1)和步骤(b1)的两个变体的突变组合在一个变体中，以及(c2)选择和/或筛选能切割嵌合DNA靶序列的步骤(c1)的变体，所述嵌合DNA靶序列包含所述第一变体DNA靶标半位点的第一部分和所述第二变体DNA靶标半位点的第二部分。
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