[发明专利]重组人血管内皮细胞生长因子的分离纯化、体外化学标记及其应用

摘要

本发明属于生物技术领域。血管内皮细胞生长因子(VEGF)在血管新生或增生中起着重要作用，但体内天然的VEGF含量低且半衰期短，故很难提取到足够量的内源VEGF蛋白以满足日益增长的实验研究及临床需要。本发明公开了一种以重组基因工程及免疫亲和层析柱法经济方便地制备及提取纯化重组人VEGF蛋白的方法。本发明还公开了对纯化的VEGF蛋白进行体外非放射性化学偶联标记处理的方法。本发明的VEGF蛋白(包括未标记的或化学偶联标记的)在实验研究及临床诊疗上具有广泛的用途。

主权项

1. 一种以重组基因工程及免疫亲和层析技术来制备及分离提取重组人血管内皮细胞生长因子(VEGF)蛋白的方法，其特征在于其包括下列步骤：1)以多聚酶链式反应(RT-PCR)从健康人细胞组织中克隆获得含编码人VEGF蛋白质的cDNA；2)克隆扩增获得的cDNA经限制性内切酶处理后，再用T4连接酶将其与经相应的限制性内切酶处理的表达载体相连，获得重组表达载体；3)将上述重组表达载体转入真核宿主细胞，经筛选、扩增培养后获得高效稳定分泌表达重组人VEGF蛋白的宿主细胞；4)收集细胞培养上清液，经离心及以滤膜过滤后，将滤液直接上样至含有偶联有VEGF受体蛋白或抗-VEGF抗体蛋白的亲合层析柱中；5)亲合层析柱先经PBS洗脱后，再以低pH液洗脱回收被吸附的蛋白；6)洗脱回收的蛋白再经调节pH至中性及透析与理化鉴定后，即获得纯化的重组人VEGF蛋白。