[发明专利]一种腈水合酶基因工程菌的构建方法以及基因工程菌株和应用

摘要

本发明公开了一种腈水合酶基因工程菌的构建方法，主要是利用诺卡氏菌/红球菌－大肠杆菌穿梭质粒在诺卡氏菌/红球菌和大肠杆菌中都能复制的特点构建能高表达腈水合酶的重组穿梭质粒，然后用电穿孔法转化诺卡氏菌和紫红红球菌宿主获得基因重组诺卡氏菌和基因重组紫红红球菌。应用该方法构建了能高表达腈水合酶的诺卡氏菌TH－1和紫红红球菌TH－2，该菌株能高表达腈水合酶，并且酶活水平高，热稳定性好，对丙烯腈和丙烯酰胺耐受性好；此外本发明还公开了利用基因工程菌株生产丙烯酰胺的方法，用该方法生产的丙烯酰胺质量高。

主权项

1.一种高效表达腈水合酶基因工程菌的构建方法，按照如下步骤进行：(1)根据目的启动子基因的DNA序列设计引物，以含有目的启动子基因的DNA为模板进行PCR方法扩增，得到启动子基因； (2)将启动子基因与诺卡氏菌-大肠杆菌穿梭质粒分别进行双酶切，36～38℃反应过夜；然后将酶切产物纯化，再用T4 DNA连接酶在3～5℃进行连接反应14～16h，得连接反应物；(3)将连接反应物转化宿主菌E.coli JM109感受态细胞，涂布LB平板(kan+)，挑选阳性克隆，并进行培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，可得带有目的启动子基因的诺卡氏菌-大肠杆菌穿梭质粒；(4)根据腈水合酶基因序列设计上、下游引物，并以具有原始腈水合酶基因的诺卡氏菌Nocardia YS-2002的总DNA为模板进行PCR扩增，得腈水合酶的DNA序列；然后用EcoRI和BamHI进行双酶切，再用T4连接酶将腈水合酶DNA序列插入大肠杆菌质粒pET28，获得重组质粒pET28-NHase；再用试剂盒定点突变方法将腈水合酶基因的α亚基起始密码子gtg突变为atg，获得突变腈水合酶基因NHaseM；(5)以步骤(4)获得的突变腈水合酶基因NHaseM的DNA序列为模板进行PCR扩增，获得突变腈水合酶基因NHaseM的DNA序列，然后用BamHI和HindIII对突变腈水合酶基因NHaseM与诺卡氏菌-大肠杆菌穿梭质粒进行双酶切，36～38℃反应过夜；然后将酶切产物纯化，再用T4 DNA连接酶在3～5℃进行连接反应14-16h，得连接反应物；(6)将步骤(5)连接反应物转化宿主菌E.coli JM109感受态细胞，然后涂布在LB平板(Kan+)培养基上，挑选阳性克隆，并在LB培养基中37℃过夜培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，可得带有目的启动子基因及突变腈水合酶基因NHaseM的穿梭质粒；(7)将步骤(6)所得穿梭质粒以电穿孔转化法转化宿主细胞，即获得具有目的启动子基因和突变腈水合酶基因NHaseM的基因工程菌。