[发明专利]构建表达预定糖链修饰糖蛋白工程菌株的方法

摘要

本发明涉及蛋白质糖基化工程领域，本发明涉及借助基因工程手段构建表达预定糖链修饰的工程菌株的方法，本发明还涉及对糖蛋白N－糖基化修饰糖链的设计与改造，使糖蛋白可以根据需要含有结构选自Man₅GlcNAc₂、GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂或SAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂的修饰糖链。

主权项

1.一种构建表达预定糖链修饰糖蛋白工程菌株的方法，该方法包括下列步骤：a)以编码糖苷酶α-1，2-甘露糖苷酶或其功能结构域的编码序列替换α-1，3-甘露糖基转移酶或α-1，6-甘露糖基转移酶基因的内部编码序列，构建同源重组突变基因序列；b)将步骤a)获得的重组突变基因序列插入具有筛选标志序列的载体中，得到重组质粒；c)将N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I和β-1，4-半乳糖基转移酶的编码序列的编码序列分别与各自定位信号编码序列相连接，得到两种融合基因序列；d)将步骤c)获得的两种融合基因序列插入具有筛选标志序列的载体中，得到重组质粒；e)将α-2，6-唾液酸转移酶编码序列和唾液酸转运蛋白编码序列连接，得到融合基因序列f)向载体中插入唾液酸合成酶编码序列使与载体内的筛选标志编码序列相连接，然后再向载体中插入步骤e)获得的融合基因序列，得到重组质粒；g)将(i)步骤a)得到的重组质粒，(ii)步骤a)和步骤b)得到的重组质粒，或者(iii)步骤a)、b)和c)得到的重组质粒，导入工程菌株，借助筛选标志筛选发生表型改变的工程菌株；h)在培养基中对所述工程菌株进行培养和诱导表达，收集上清中的糖蛋白并对其N-糖基化修饰糖链进行分析，确认工程菌株表达的糖蛋白N-糖基化修饰为预定糖链。