[发明专利]快速高通量筛选多环芳烃降解菌的改进固体双层平板法

摘要

本发明涉及一种快速高通量筛选多环芳烃降解菌的改进固体双层平板法，属于污染土壤生物修复技术领域，适用于多环芳烃污染土壤生物修复微生物资源的挖掘。所采用的固体双层平板法，下层培养基为普通无机盐琼脂培养基添加多种维生素和微量元素；上层培养基为以多环芳烃为唯一碳源的无机盐低熔点琼脂糖培养基，选择低熔点琼脂糖代替普通琼脂制作上层培养基，一方面可防止加入PAHs时由于高温导致的降解或者挥发；另一方面可使降解暗圈更清晰易辨。本发明针对传统降解菌株筛选的盲目性、随机性且工作量大、费时费力等缺点，开发的固体双层平板法，为在实验室中高通量筛选多环芳烃降解菌，挖掘新的生物修复微生物资源提供了一种快速便捷的手段。

主权项

1、一种快速高通量筛选多环芳烃降解菌的改进固体双层平板法，其特征在于，下层培养基采用普通无机盐琼脂培养基添加多种维生素和微量元素；上层培养基为以多环芳烃为唯一碳源的无机盐固体培养基，但选择低熔点琼脂糖代替普通琼脂；具体步骤如下：1)土壤样品采集和处理：采集表层土壤样品，过1mm筛，4℃冰箱保存；2)多环芳烃耐受菌群的富集培养：采用逐步提高底物浓度的方法对多环芳烃耐受菌群进行富集培养；3)多环芳烃耐受菌群的分离：将2)中的富集培养液采用无菌生理盐水在无菌条件下进行10倍系列梯度稀释，取0.1ml、稀释度为10-5～10-7的富集培养液涂布LB固体培养基，置于30℃恒温培养箱中，培养48h；挑取具有不同菌落形态的单菌落各若干株，重新点种于LB固体培养基，并对菌落进行顺序编号，置于30℃恒温培养箱中，培养48h；4)多环芳烃固体双层平板制备：在无菌的平皿中先倾入20ml下层培养基，既固体无机盐培养基添加0.1ml/L维生素母液；待下层培养基凝固后，再加入10ml上层培养基，既以PAHs为唯一碳源的固体无机盐低熔点琼脂糖培养基；上层培养基配制方法：量取重量浓度1％PAHs无菌乙醇溶液100μl，加入10ml冷却至35℃的无机盐低熔点琼脂糖培养基中，使PAHs终浓度为100mgL-1；5)应用双层平板法高通量筛选多环芳烃降解菌：用灭菌牙签将3)中培养好的菌落点种于4)中制备的多环芳烃固体双层平板上，30℃恒温培养箱中，培养2～4周；在紫外灯下观察，菌落周围出现降解暗圈则表明底物被降解，该菌株可确认为多环芳烃降解菌。