[发明专利]抗菌抗结核植物内生菌的分离筛选方法

摘要

本发明公开了抗菌抗结核植物内生菌的分离筛选方法，该方法包括抗菌抗结核植物组织的准备、表面消毒与无菌检测、植物内生菌的分离纯化、内生真菌发酵、内生细菌发酵、发酵液的处理、菌体的处理、有效抗菌菌株筛选、有效抗结核菌株筛选和菌种的保存步骤。本发明为实现从微生物中获取有效抗菌抗结核物质提供了保证，通过本发明获得一批有效的菌株。

主权项

1.一种抗菌抗结核植物内生菌的分离筛选方法，其特征是步骤如下：(1)抗菌抗结核植物组织的准备：采集植物的根、茎、叶、果实等组织；(2)表面消毒与无菌检测：在无菌工作台内，将步骤(1)各部分组织用无菌水冲洗3次，采用75％酒精+0.1％升汞组合进行表面消毒，无菌水冲洗5次后，种植于水琼脂培养基中，27℃下恒温培养，表面消毒的最后一次冲洗用无菌水作为空白对照；(3)植物内生菌的分离纯化：将步骤(2)长出的内生菌，挑取不同形态的菌落，真菌至PDA培养基，细菌至牛肉浸膏固体培养基中，划线培养至纯后，保存于相应的试管斜面中备用；(4)内生真菌发酵：将PDA液体培养基分装在三角瓶中，用接种环挑取少许步骤(3)纯化的内生真菌菌丝于培养瓶中，置27℃摇床，150r/min，振荡培养6-7天，发酵液经4000r/min离心10-15min，取上清液；(5)内生细菌发酵：将牛肉浸膏液体培养基分装在三角瓶中，用接种环挑取少许步骤(3)纯化的内生细菌菌落于培养瓶中，置37℃摇床，150r/min，振荡培养2-3天，发酵液经4000r/min离心10-15min，取上清液；(6)发酵液的处理：向步骤(4)、(5)的上清液中加入95％的乙醇，混合后使乙醇浓度为75％，静置过夜，处理液4000r/min离心10-15min，取上清液，40℃减压蒸馏，真空干燥后保存于4℃冰箱备用；(7)菌体的处理：将步骤(4)、(5)的菌体置于圆底烧瓶用等量的丙酮或乙酸乙酯水浴回流提取2h，浸提两次，4000r/min离心20min，60℃减压蒸馏，浓缩干燥后保存于4℃冰箱备用；(8)有效抗菌菌株筛选：称取步骤(6)、(7)粉末，加入一定无菌水，使药液浓度为10mg/ml，采用改进K-B纸片法，通过测量菌圈大小，判断抑制效果；(9)有效抗结核菌株筛选：将10mg/ml药液与一定改良罗氏培养基混合成斜面后，接种浓度为103mg/ml的人型结核分枝杆菌，接种量为0.1ml，37℃培养，观察菌落出现情况；(10)菌种的保存：将步骤(7)筛选出的高抑制效率内生菌菌株接种于25％无菌甘油中，-80℃保存，备用。